ऑटोलॉगस न्यूक्लियस पल्पोसस को काठ का सबचॉन्ड्रल हड्डी में प्रत्यारोपित किया गया

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MODIC CHANGE (MC) के पशु मॉडल की स्थापना MC का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण आधार है। चौबीस न्यूजीलैंड के सफेद खरगोशों को शम-ऑपरेशन ग्रुप, मसल इम्प्लांटेशन ग्रुप (एमई ग्रुप) और न्यूक्लियस पल्पोसस इम्प्लांटेशन ग्रुप (एनपीई ग्रुप) में विभाजित किया गया था। एनपीई समूह में, इंटरवर्टेब्रल डिस्क को एटरोलॉटरल लम्बर सर्जिकल दृष्टिकोण द्वारा उजागर किया गया था और अंत प्लेट के पास एल 5 कशेरुक शरीर को पंचर करने के लिए एक सुई का उपयोग किया गया था। एनपी को एक सिरिंज द्वारा L1/2 इंटरवर्टेब्रल डिस्क से निकाला गया था और इसमें इंजेक्ट किया गया था। सबचॉन्ड्रल हड्डी में एक छेद ड्रिलिंग। मांसपेशियों के आरोपण समूह और शम-ऑपरेशन समूह में सर्जिकल प्रक्रियाएं और ड्रिलिंग तरीके एनपी आरोपण समूह में समान थे। एमई समूह में, मांसपेशियों का एक टुकड़ा छेद में रखा गया था, जबकि शम-ऑपरेशन समूह में, छेद में कुछ भी नहीं रखा गया था। ऑपरेशन के बाद, एमआरआई स्कैनिंग और आणविक जैविक परीक्षण किया गया। एनपीई समूह में संकेत बदल गया, लेकिन शम-ऑपरेशन समूह और एमई समूह में कोई स्पष्ट संकेत परिवर्तन नहीं हुआ। हिस्टोलॉजिकल अवलोकन से पता चला कि आरोपण स्थल पर असामान्य ऊतक प्रसार देखा गया था, और एनपीई समूह में IL-4, IL-17 और IFN-γ की अभिव्यक्ति बढ़ गई थी। उपचंड्रल हड्डी में एनपी का आरोपण एमसी का एक पशु मॉडल बना सकता है।
मोडिक चेंज (एमसी) कशेरुकी एंडप्लेट्स और आसन्न अस्थि मज्जा के घाव हैं जो चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) पर दिखाई देते हैं। वे संबंधित लक्षण 1 वाले व्यक्तियों में काफी आम हैं। कई अध्ययनों ने कम पीठ दर्द (एलबीपी) 2,3 के साथ इसके सहयोग के कारण एमसी के महत्व पर जोर दिया है। डी रूओस एट अल .4 और मोडिक एट अल। MODIC प्रकार I परिवर्तन T1- भारित (T1W) अनुक्रमों पर हाइपोथेन्स और T2- भारित (T2W) अनुक्रमों पर हाइपरिंटेंस हैं। इस घाव से अस्थि मज्जा में फिशर एंडप्लेट और आसन्न संवहनी दानेदार ऊतक का पता चलता है। MODIC प्रकार II परिवर्तन T1W और T2W दोनों अनुक्रमों पर उच्च संकेत दिखाते हैं। इस प्रकार के घाव में, एंडप्लेट विनाश पाया जा सकता है, साथ ही आसन्न अस्थि मज्जा के हिस्टोलॉजिकल फैटी प्रतिस्थापन भी। MODIC प्रकार III परिवर्तन T1W और T2W अनुक्रमों में कम संकेत दिखाते हैं। एंडप्लेट के अनुरूप स्केलेरोटिक घावों को देखा गया है 6। एमसी को रीढ़ का एक रोग संबंधी बीमारी माना जाता है और यह स्पाइन 7,8,9 के कई अपक्षयी रोगों के साथ निकटता से जुड़ा हुआ है।
उपलब्ध आंकड़ों को ध्यान में रखते हुए, कई अध्ययनों ने एमसी के एटियलजि और पैथोलॉजिकल तंत्र में विस्तृत अंतर्दृष्टि प्रदान की है। अल्बर्ट एट अल। सुझाव दिया कि एमसी डिस्क हर्नियेशन 8 के कारण हो सकता है। हू एट अल। गंभीर डिस्क अध: पतन 10 के लिए MC को जिम्मेदार ठहराया। KROC ने "आंतरिक डिस्क टूटना" की अवधारणा का प्रस्ताव किया, जिसमें कहा गया है कि दोहरावदार डिस्क आघात एंडप्लेट में माइक्रोटर्स को जन्म दे सकता है। फांक गठन के बाद, नाभिक पल्पोसस (एनपी) द्वारा एंडप्लेट विनाश एक ऑटोइम्यून प्रतिक्रिया को ट्रिगर कर सकता है, जो आगे MC11 के विकास की ओर जाता है। मा एट अल। एक समान दृष्टिकोण साझा किया और बताया कि एनपी-प्रेरित ऑटोइम्यूनिटी MC12 के रोगजनन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।
इम्यून सिस्टम सेल, विशेष रूप से CD4+ T हेल्पर लिम्फोसाइट्स, ऑटोइम्यूनिटी 13 के रोगजनन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। हाल ही में खोजा गया Th17 सबसेट प्रिनफ्लेमेटरी साइटोकाइन IL-17 का उत्पादन करता है, केमोकाइन अभिव्यक्ति को बढ़ावा देता है, और क्षतिग्रस्त अंगों में टी कोशिकाओं को IFN-γ14 का उत्पादन करने के लिए उत्तेजित करता है। TH2 कोशिकाएं भी प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के रोगजनन में एक अनूठी भूमिका निभाती हैं। एक प्रतिनिधि Th2 सेल के रूप में IL-4 की अभिव्यक्ति गंभीर इम्यूनोपैथोलॉजिकल परिणाम 15 हो सकती है।
हालांकि कई नैदानिक ​​अध्ययन MC16,17,18,18,19,20,21,22,23,23,24 पर किए गए हैं, फिर भी उपयुक्त पशु प्रयोगात्मक मॉडल की कमी है जो एमसी प्रक्रिया की नकल कर सकती है जो अक्सर मनुष्यों में होती है और हो सकती है लक्षित चिकित्सा जैसे एटियलजि या नए उपचारों की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है। आज तक, एमसी के केवल कुछ पशु मॉडल को अंतर्निहित पैथोलॉजिकल तंत्र का अध्ययन करने के लिए सूचित किया गया है।
अल्बर्ट और एमए द्वारा प्रस्तावित ऑटोइम्यून सिद्धांत के आधार पर, इस अध्ययन ने ड्रिल किए गए कशेरुका अंत प्लेट के पास एनपी को ऑटोट्रांसप्लांटिंग द्वारा एक सरल और प्रजनन योग्य खरगोश एमसी मॉडल की स्थापना की। अन्य उद्देश्य पशु मॉडल की हिस्टोलॉजिकल विशेषताओं का निरीक्षण करना और एमसी के विकास में एनपी के विशिष्ट तंत्र का मूल्यांकन करना है। यह अंत करने के लिए, हम एमसी की प्रगति का अध्ययन करने के लिए आणविक जीव विज्ञान, एमआरआई और हिस्टोलॉजिकल अध्ययन जैसी तकनीकों का उपयोग करते हैं।
सर्जरी के दौरान रक्तस्राव से दो खरगोशों की मौत हो गई, और एमआरआई के दौरान एनेस्थीसिया के दौरान चार खरगोशों की मौत हो गई। शेष 48 खरगोश बच गए और सर्जरी के बाद कोई व्यवहार या न्यूरोलॉजिकल संकेत नहीं दिखाए।
एमआरआई से पता चलता है कि अलग -अलग छेदों में एम्बेडेड ऊतक की संकेत तीव्रता अलग है। NPE समूह में L5 कशेरुक शरीर की संकेत तीव्रता धीरे -धीरे 12, 16 और 20 सप्ताह के बाद बदल गई (T1W अनुक्रम ने कम सिग्नल दिखाया, और T2W अनुक्रम ने मिश्रित सिग्नल प्लस कम सिग्नल दिखाया) (छवि 1 सी), जबकि एमआरआई दिखावे एम्बेडेड भागों के अन्य दो समूह एक ही अवधि (छवि 1 ए, बी) के दौरान अपेक्षाकृत स्थिर रहे।
(ए) 3 समय बिंदुओं पर खरगोश काठ की रीढ़ के प्रतिनिधि अनुक्रमिक एमआरआई। शम-ऑपरेशन समूह की छवियों में कोई संकेत असामान्यताएं नहीं पाई गईं। (बी) एमई समूह में कशेरुक निकाय की संकेत विशेषताएं शम-ऑपरेशन समूह में उन लोगों के समान हैं, और समय के साथ एम्बेडिंग साइट पर कोई महत्वपूर्ण संकेत परिवर्तन नहीं देखा जाता है। (C) NPE समूह में, T1W अनुक्रम में कम संकेत स्पष्ट रूप से दिखाई देता है, और T2W अनुक्रम में मिश्रित संकेत और कम संकेत स्पष्ट रूप से दिखाई देते हैं। 12-सप्ताह की अवधि से 20-सप्ताह की अवधि तक, T2W अनुक्रम में कम संकेतों के आसपास के छिटपुट उच्च संकेत कम हो जाते हैं।
स्पष्ट हड्डी हाइपरप्लासिया को एनपीई समूह में कशेरुका शरीर के आरोपण स्थल पर देखा जा सकता है, और एनपीई समूह की तुलना में 12 से 20 सप्ताह (छवि 2 सी) से हड्डी हाइपरप्लासिया तेजी से होती है, मॉडल किए गए कशेरुकी में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं देखा जाता है, जो कि मॉडलेड कशेरुक में नहीं देखा जाता है। निकाय; शम ग्रुप और एमई ग्रुप (छवि 2 सी) 2 ए, बी)।
(ए) प्रत्यारोपित भाग में कशेरुक शरीर की सतह बहुत चिकनी है, छेद अच्छी तरह से ठीक हो जाता है, और कशेरुक शरीर में कोई हाइपरप्लासिया नहीं है। (बी) एमई समूह में प्रत्यारोपित साइट का आकार शम ऑपरेशन समूह में उसी के समान है, और समय के साथ प्रत्यारोपित साइट की उपस्थिति में कोई स्पष्ट परिवर्तन नहीं है। (C) एनपीई समूह में प्रत्यारोपित साइट पर बोन हाइपरप्लासिया हुआ। हड्डी हाइपरप्लासिया तेजी से बढ़ी और यहां तक ​​कि इंटरवर्टेब्रल डिस्क के माध्यम से विपरीत कशेरुक शरीर तक बढ़ा।
हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण हड्डी के गठन के बारे में अधिक विस्तृत जानकारी प्रदान करता है। चित्रा 3 एच एंड ई के साथ दागे गए पोस्टऑपरेटिव वर्गों की तस्वीरों को दर्शाता है। शम-ऑपरेशन ग्रुप में, चोंड्रोसाइट्स को अच्छी तरह से व्यवस्थित किया गया था और कोई सेल प्रसार का पता नहीं लगाया गया था (छवि 3 ए)। एमई समूह की स्थिति शम-ऑपरेशन ग्रुप (छवि 3 बी) में उसी के समान थी। हालांकि, एनपीई समूह में, बड़ी संख्या में चोंड्रोसाइट्स और एनपी जैसी कोशिकाओं के प्रसार को आरोपण स्थल (छवि 3 सी) में देखा गया था;
(ए) ट्रैबेकुला को अंत प्लेट के पास देखा जा सकता है, चोंड्रोसाइट्स को बड़े करीने से समान सेल आकार और आकार और कोई प्रसार (40 बार) के साथ व्यवस्थित किया जाता है। (B) ME समूह में आरोपण स्थल की स्थिति शम समूह के समान है। Trabeculae और chondrocytes देखे जा सकते हैं, लेकिन आरोपण स्थल (40 बार) में कोई स्पष्ट प्रसार नहीं है। (बी) यह देखा जा सकता है कि चोंड्रोसाइट्स और एनपी जैसी कोशिकाएं काफी आगे बढ़ती हैं, और चोंड्रोसाइट्स का आकार और आकार असमान (40 बार) होता है।
इंटरल्यूकिन 4 (IL-4) mRNA, इंटरल्यूकिन 17 (IL-17) mRNA, और इंटरफेरॉन ((IFN-γ) mRNA की अभिव्यक्ति NPE और ME समूहों दोनों में देखी गई। जब लक्ष्य जीनों की अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना की गई थी, तो IL-4, IL-17, और IFN-of के जीन अभिव्यक्तियों को ME समूह और SHAM ऑपरेशन समूह (छवि 4) की तुलना में NPE समूह में काफी बढ़ा दिया गया था। (पी <0.05)। SHAM ऑपरेशन समूह की तुलना में, ME समूह में IL-4, IL-17, और IFN-γ की अभिव्यक्ति का स्तर केवल थोड़ा बढ़ गया और सांख्यिकीय परिवर्तन (P> 0.05) तक नहीं पहुंचा।
NPE समूह में IL-4, IL-17 और IFN-of की mRNA अभिव्यक्ति ने SHAM ऑपरेशन समूह और ME समूह (P <0.05) की तुलना में काफी अधिक प्रवृत्ति दिखाई।
इसके विपरीत, एमई समूह में अभिव्यक्ति के स्तर में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया गया (पी> 0.05)।
परिवर्तित mRNA अभिव्यक्ति पैटर्न की पुष्टि करने के लिए IL-4 और IL-17 के खिलाफ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी का उपयोग करके पश्चिमी धब्बा विश्लेषण किया गया था। जैसा कि एमई समूह और शम ऑपरेशन समूह के साथ तुलना में आंकड़े 5 ए, बी में दिखाया गया है, एनपीई समूह में आईएल -4 और आईएल -17 के प्रोटीन स्तर में काफी वृद्धि हुई थी (पी <0.05)। SHAM ऑपरेशन समूह की तुलना में, ME समूह में IL-4 और IL-17 का प्रोटीन स्तर भी सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण परिवर्तनों (P> 0.05) तक पहुंचने में विफल रहा।
(ए) एनपीई समूह में आईएल -4 और आईएल -17 का प्रोटीन स्तर एमई समूह और प्लेसबो समूह (पी <0.05) की तुलना में काफी अधिक था। (B) पश्चिमी धब्बा हिस्टोग्राम।
सर्जरी के दौरान प्राप्त मानव नमूनों की सीमित संख्या के कारण, एमसी के रोगजनन पर स्पष्ट और विस्तृत अध्ययन कुछ हद तक मुश्किल हैं। हमने इसके संभावित पैथोलॉजिकल तंत्र का अध्ययन करने के लिए MC का एक पशु मॉडल स्थापित करने का प्रयास किया। इसी समय, एनपी ऑटोग्राफ़्ट द्वारा प्रेरित एमसी के पाठ्यक्रम का पालन करने के लिए रेडियोलॉजिकल मूल्यांकन, हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन और आणविक जैविक मूल्यांकन का उपयोग किया गया था। नतीजतन, एनपी आरोपण मॉडल के परिणामस्वरूप 12-सप्ताह से 20-सप्ताह के समय बिंदुओं (T1W अनुक्रमों में मिश्रित कम सिग्नल और T2W अनुक्रमों में कम सिग्नल), ऊतक परिवर्तन का संकेत मिलता है, और हिस्टोलॉजिकल और आणविक का संकेत मिलता है। जैविक मूल्यांकन ने रेडियोलॉजिकल अध्ययन के परिणामों की पुष्टि की।
इस प्रयोग के परिणाम बताते हैं कि एनपीई समूह में कशेरुक शरीर के उल्लंघन की साइट पर दृश्य और हिस्टोलॉजिकल परिवर्तन हुए। इसी समय, IL-4, IL-17 और IFN-of जीन, साथ ही IL-4, IL-17 और IFN-γ की अभिव्यक्ति देखी गई, यह दर्शाता है कि कशेरुक में ऑटोलॉगस न्यूक्लियस पल्पोसस ऊतक का उल्लंघन शरीर संकेत और रूपात्मक परिवर्तनों की एक श्रृंखला का कारण हो सकता है। यह पता लगाना आसान है कि पशु मॉडल के कशेरुक निकायों की सिग्नल विशेषताएं (T1W अनुक्रम में कम सिग्नल, मिश्रित सिग्नल और T2W अनुक्रम में कम सिग्नल) मानव कशेरुक कोशिकाओं के समान हैं, और MRI विशेषताओं के लिए भी हिस्टोलॉजी और सकल शरीर रचना की टिप्पणियों की पुष्टि करें, अर्थात्, कशेरुक शरीर की कोशिकाओं में परिवर्तन प्रगतिशील हैं। यद्यपि तीव्र आघात के कारण होने वाली भड़काऊ प्रतिक्रिया पंचर के बाद जल्द ही दिखाई दे सकती है, एमआरआई परिणामों से पता चला कि उत्तरोत्तर बढ़ते सिग्नल परिवर्तन पंचर के 12 सप्ताह बाद दिखाई दिए और एमआरआई परिवर्तनों के पुनर्प्राप्ति या उलटफेर के किसी भी संकेत के बिना 20 सप्ताह तक बने रहे। इन परिणामों से पता चलता है कि ऑटोलॉगस कशेरुक एनपी खरगोशों में प्रगतिशील एमवी स्थापित करने के लिए एक विश्वसनीय तरीका है।
इस पंचर मॉडल को पर्याप्त कौशल, समय और सर्जिकल प्रयास की आवश्यकता होती है। प्रारंभिक प्रयोगों में, पैरावर्टेब्रल लिगामेंटस संरचनाओं के विच्छेदन या अत्यधिक उत्तेजना के परिणामस्वरूप कशेरुक ओस्टियोफाइट्स का गठन हो सकता है। आसन्न डिस्क को नुकसान या जलन नहीं करने के लिए देखभाल नहीं की जानी चाहिए। चूंकि लगातार और प्रजनन योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए प्रवेश की गहराई को नियंत्रित किया जाना चाहिए, इसलिए हमने मैन्युअल रूप से 3 मिमी लंबी सुई के म्यान को काटकर एक प्लग बनाया। इस प्लग का उपयोग करना कशेरुक शरीर में एक समान ड्रिलिंग गहराई सुनिश्चित करता है। प्रारंभिक प्रयोगों में, ऑपरेशन में शामिल तीन आर्थोपेडिक सर्जनों में 16-गेज सुइयों को 18-गेज सुइयों या अन्य तरीकों के साथ काम करना आसान पाया गया। ड्रिलिंग के दौरान अत्यधिक रक्तस्राव से बचने के लिए, सुई को थोड़ी देर के लिए अभी भी पकड़ना अधिक उपयुक्त सम्मिलन छेद प्रदान करेगा, यह सुझाव देता है कि इस तरह से एमसी की एक निश्चित डिग्री को नियंत्रित किया जा सकता है।
हालांकि कई अध्ययनों ने एमसी को लक्षित किया है, बहुत कम लोग MC25,26,27 के एटियलजि और रोगजनन के बारे में जानते हैं। हमारे पिछले अध्ययनों के आधार पर, हमने पाया कि ऑटोइम्यूनिटी MC12 की घटना और विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इस अध्ययन ने IL-4, IL-17 और IFN-and की मात्रात्मक अभिव्यक्ति की जांच की, जो एंटीजन उत्तेजना के बाद CD4+ कोशिकाओं के मुख्य भेदभाव मार्ग हैं। हमारे अध्ययन में, नकारात्मक समूह की तुलना में, NPE समूह में IL-4, IL-17, और IFN-and की उच्च अभिव्यक्ति थी, और IL-4 और IL-17 के प्रोटीन स्तर भी अधिक थे।
नैदानिक ​​रूप से, IL-17 mRNA अभिव्यक्ति को DISC Herniation28 के रोगियों से NP कोशिकाओं में बढ़ाया जाता है। बढ़ी हुई IL-4 और IFN-γ अभिव्यक्ति का स्तर भी स्वस्थ नियंत्रण 29 की तुलना में एक तीव्र गैर-संपीड़ित डिस्क हर्नियेशन मॉडल में पाया गया। IL-17 सूजन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, ऑटोइम्यून रोगों में ऊतक की चोट 30 और IFN-γ31 के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को बढ़ाता है। बढ़ाया IL-17-मध्यस्थता ऊतक की चोट MRL/LPR MICE32 और ऑटोइम्यूनिटी-अतिसंवेदनशील Mice33 में बताई गई है। IL-4 प्रिनफ्लेमेटरी साइटोकिन्स (जैसे IL-1β और TNFα) और मैक्रोफेज सक्रियण 34 की अभिव्यक्ति को रोक सकता है। यह बताया गया कि IL-4 की mRNA अभिव्यक्ति NPE समूह में IL-17 और IFN-γ की तुलना में एक ही समय बिंदु पर अलग थी; NPE समूह में IFN-γ की mRNA अभिव्यक्ति अन्य समूहों की तुलना में काफी अधिक थी। इसलिए, IFN-γ उत्पादन NP इंटरकलेशन द्वारा प्रेरित भड़काऊ प्रतिक्रिया का मध्यस्थ हो सकता है। अध्ययनों से पता चला है कि IFN-γ का उत्पादन कई सेल प्रकारों द्वारा किया जाता है, जिसमें सक्रिय टाइप 1 हेल्पर टी कोशिकाएं, प्राकृतिक हत्यारे कोशिकाएं और मैक्रोफेज 35,36 शामिल हैं, और एक प्रमुख समर्थक भड़काऊ साइटोकाइन है जो प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 37 को बढ़ावा देता है।
इस अध्ययन से पता चलता है कि ऑटोइम्यून प्रतिक्रिया एमसी की घटना और विकास में शामिल हो सकती है। लुओमा एट अल। पाया गया कि एमसी और प्रमुख एनपी की सिग्नल विशेषताएं एमआरआई पर समान हैं, और दोनों T2W अनुक्रम 38 में उच्च संकेत दिखाते हैं। कुछ साइटोकिन्स की पुष्टि की गई है कि मैं IL-139 जैसे MC की घटना के साथ निकटता से जुड़ा हुआ है। मा एट अल। सुझाव दिया कि एनपी के ऊपर या नीचे की ओर फलाव MC12 की घटना और विकास पर बहुत प्रभाव हो सकता है। Bobechko40 और Herzbein et al.41 ने बताया कि NP एक इम्यूनोटोलरेंट ऊतक है जो जन्म से संवहनी परिसंचरण में प्रवेश नहीं कर सकता है। एनपी प्रोट्रूशियंस विदेशी निकायों को रक्त की आपूर्ति में पेश करता है, जिससे स्थानीय ऑटोइम्यून प्रतिक्रियाएं 42 की मध्यस्थता होती है। ऑटोइम्यून प्रतिक्रियाएं बड़ी संख्या में प्रतिरक्षा कारकों को प्रेरित कर सकती हैं, और जब ये कारक लगातार ऊतकों के संपर्क में आते हैं, तो वे सिग्नलिंग 43 में परिवर्तन का कारण बन सकते हैं। इस अध्ययन में, IL-4, IL-17 और IFN-of के ओवरएक्प्रेशन विशिष्ट प्रतिरक्षा कारक हैं, जो NP और MCS44 के बीच घनिष्ठ संबंध को और साबित करते हैं। यह पशु मॉडल अच्छी तरह से एनपी सफलता और अंत प्लेट में प्रवेश की नकल करता है। इस प्रक्रिया ने एमसी पर ऑटोइम्यूनिटी के प्रभाव को और पता चला।
जैसा कि अपेक्षित था, यह पशु मॉडल हमें MC का अध्ययन करने के लिए एक संभावित मंच प्रदान करता है। हालांकि, इस मॉडल की अभी भी कुछ सीमाएँ हैं: सबसे पहले, पशु अवलोकन चरण के दौरान, कुछ मध्यवर्ती-चरण खरगोशों को हिस्टोलॉजिकल और आणविक जीव विज्ञान परीक्षण के लिए इच्छामृत्यु की जानी चाहिए, इसलिए कुछ जानवरों को समय के साथ "उपयोग से बाहर" गिरते हैं। दूसरे, हालांकि इस अध्ययन में तीन समय अंक निर्धारित किए गए हैं, दुर्भाग्य से, हमने केवल एक प्रकार के MC (MODIC प्रकार I परिवर्तन) को मॉडल किया है, इसलिए यह मानव रोग विकास प्रक्रिया का प्रतिनिधित्व करने के लिए पर्याप्त नहीं है, और अधिक समय बिंदुओं को सेट करने की आवश्यकता है बेहतर सभी सिग्नल परिवर्तनों का निरीक्षण करें। तीसरा, ऊतक संरचना में परिवर्तन वास्तव में हिस्टोलॉजिकल धुंधला द्वारा स्पष्ट रूप से दिखाया जा सकता है, लेकिन कुछ विशेष तकनीकें इस मॉडल में माइक्रोस्ट्रक्चरल परिवर्तनों को बेहतर ढंग से प्रकट कर सकती हैं। उदाहरण के लिए, खरगोश इंटरवर्टेब्रल डिस्क 45 में फाइब्रोकार्टिलेज के गठन का विश्लेषण करने के लिए ध्रुवीकृत प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया गया था। एमसी और एंडप्लेट पर एनपी के दीर्घकालिक प्रभावों को आगे के अध्ययन की आवश्यकता है।
चौबीस पुरुष न्यूजीलैंड सफेद खरगोश (वजन लगभग 2.5-3 किलोग्राम, आयु 3-3.5 महीने) को यादृच्छिक रूप से शम ऑपरेशन समूह, मांसपेशी आरोपण समूह (एमई समूह) और तंत्रिका रूट प्रत्यारोपण समूह (एनपीई समूह) में विभाजित किया गया था। सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को तियानजिन अस्पताल की नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था, और प्रयोगात्मक तरीकों को अनुमोदित दिशानिर्देशों के अनुसार सख्त किया गया था।
एस। सोबजिमा 46 की सर्जिकल तकनीक में कुछ सुधार किए गए हैं। प्रत्येक खरगोश को एक पार्श्व पुनरावृत्ति की स्थिति में रखा गया था और पांच लगातार काठ का इंटरवर्टेब्रल डिस्क (आईवीडी) की पूर्वकाल सतह को एक पोस्टेरोलॉजिकल रेट्रोपरिटोनियल दृष्टिकोण का उपयोग करके उजागर किया गया था। प्रत्येक खरगोश को सामान्य संज्ञाहरण (20% urethane, 5 एमएल/किग्रा कान की नस के माध्यम से) दिया गया था। एक अनुदैर्ध्य त्वचा चीरा पसलियों के निचले किनारे से पेल्विक ब्रिम तक बनाया गया था, 2 सेमी वेंट्रल से पैरावर्टेब्रल की मांसपेशियों तक। L1 से L6 तक की सही एटरोलॉजिकल रीढ़ को चमड़े के नीचे के ऊतक, रेट्रोपरिटोनियल ऊतक और मांसपेशियों (छवि 6 ए) के तेज और कुंद विच्छेदन द्वारा उजागर किया गया था। डिस्क स्तर को L5-L6 डिस्क स्तर के लिए एक शारीरिक लैंडमार्क के रूप में पेल्विक ब्रिम का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। 3 मिमी (छवि 6 बी) की गहराई तक L5 कशेरुका की अंत प्लेट के पास एक छेद ड्रिल करने के लिए 16-गेज पंचर सुई का उपयोग करें। L1-L2 इंटरवर्टेब्रल डिस्क (छवि 6C) में ऑटोलॉगस न्यूक्लियस पल्पोसस की आकांक्षा करने के लिए 5-एमएल सिरिंज का उपयोग करें। प्रत्येक समूह की आवश्यकताओं के अनुसार नाभिक पल्पोसस या मांसपेशी निकालें। ड्रिल छेद को गहरा करने के बाद, सर्जरी के दौरान कशेरुक शरीर के पेरीओस्टियल ऊतक को नुकसान नहीं पहुंचाने के लिए गहरे प्रावरणी, सतही प्रावरणी और त्वचा पर अवशोषित टांके लगाए जाते हैं।
(ए) L5 -L6 डिस्क को एक पोस्टरोलैटरल रेट्रोपरिटोनियल दृष्टिकोण के माध्यम से उजागर किया जाता है। (B) L5 एंडप्लेट के पास एक छेद ड्रिल करने के लिए 16-गेज सुई का उपयोग करें। (C) ऑटोलॉगस एमएफएस काटा जाता है।
सामान्य एनेस्थीसिया को कान की नस के माध्यम से प्रशासित 20% urethane (5 एमएल/किग्रा) के साथ प्रशासित किया गया था, और काठ का रीढ़ रेडियोग्राफ़ 12, 16 और 20 सप्ताह के बाद के पोस्टऑपरेटिव रूप से दोहराया गया था।
सर्जरी के बाद 12, 16 और 20 सप्ताह में केटामाइन (25.0 मिलीग्राम/किग्रा) और अंतःशिरा सोडियम पेंटोबार्बिटल (1.2 ग्राम/किग्रा) के इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन द्वारा खरगोशों की बलि दी गई थी। हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए पूरी रीढ़ को हटा दिया गया था और वास्तविक विश्लेषण किया गया था। प्रतिरक्षा कारकों में परिवर्तन का पता लगाने के लिए मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन (आरटी-क्यूपीसीआर) और पश्चिमी सोख्ता का उपयोग किया गया था।
एमआरआई परीक्षाएं एक ऑर्थोगोनल लिम्ब कॉइल रिसीवर से लैस 3.0 टी क्लिनिकल चुंबक (जीई मेडिकल सिस्टम, फ्लोरेंस, एससी) का उपयोग करके खरगोशों में किए गए थे। खरगोशों को कान की नस के माध्यम से 20% urethane (5 एमएल/किग्रा) के साथ एनेस्थेटाइज़ किया गया था और फिर 5 इंच व्यास के परिपत्र सतह कॉइल (जीई मेडिकल सिस्टम) पर केंद्रित काठ के क्षेत्र के साथ चुंबक के भीतर सुपाइन रखा गया था। कोरोनल टी 2-वेटेड लोकलाइज़र इमेज (टीआर, 1445 एमएस; टीई, 37 एमएस) को एल 3-एल 4 से एल 5-एल 6 तक काठ का डिस्क के स्थान को परिभाषित करने के लिए अधिग्रहित किया गया था। Sagittal विमान T2- भारित स्लाइस को निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ अधिग्रहित किया गया था: 2200 एमएस के पुनरावृत्ति समय (टीआर) और 70 एमएस, मैट्रिक्स के एक इको समय (टीई) के साथ फास्ट स्पिन-इको अनुक्रम; 260 और आठ उत्तेजनाओं का दृश्य क्षेत्र; काटने की मोटाई 2 मिमी थी, अंतर 0.2 मिमी था।
आखिरी तस्वीर लेने के बाद और अंतिम खरगोश को मार दिया गया था, हिस्टोलॉजिकल परीक्षा के लिए शम, मांसपेशी-एम्बेडेड और एनपी डिस्क को हटा दिया गया था। ऊतकों को 1 सप्ताह के लिए 10% तटस्थ बफर फॉर्मेलिन में तय किया गया था, जो कि एथिलेनडामिनेटेटेट्रैसेटिक एसिड और पैराफिन सेक्शन के साथ डिक्लाइड किया गया था। ऊतक ब्लॉकों को पैराफिन में एम्बेड किया गया था और एक माइक्रोटोम का उपयोग करके धनु वर्गों (5 माइक्रोन मोटी) में काट दिया गया था। वर्गों को हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) के साथ दाग दिया गया था।
प्रत्येक समूह में खरगोशों से इंटरवर्टेब्रल डिस्क को इकट्ठा करने के बाद, निर्माता के निर्देशों और एक इंप्रोम II रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन सिस्टम (ProMega Inc. , मैडिसन, वाई, यूएसए)। रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किया गया था।
RT-QPCR को निर्माता के निर्देशों के अनुसार PRISM 7300 (एप्लाइड बायोसिस्टम्स इंक, यूएसए) और SYBR ग्रीन जंप स्टार्ट TAQ READYMIX (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, MO, USA) का उपयोग करके किया गया था। पीसीआर प्रतिक्रिया की मात्रा 20 μL थी और इसमें पतला सीडीएनए के 1.5 μL और प्रत्येक प्राइमर के 0.2 माइक्रोन शामिल थे। प्राइमरों को ओलिगोपरफेक्ट डिजाइनर (इनविट्रोजन, वालेंसिया, सीए) द्वारा डिजाइन किया गया था और नानजिंग गोल्डन स्टीवर्ट बायोटेक्नोलॉजी कंपनी, लिमिटेड (चीन) (तालिका 1) द्वारा निर्मित किया गया था। निम्नलिखित थर्मल साइक्लिंग स्थितियों का उपयोग किया गया था: प्रारंभिक पोलीमरेज़ सक्रियण चरण 94 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए, फिर टेम्पलेट विकृतीकरण के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर प्रत्येक 15 एस के 40 चक्र, 60 डिग्री सेल्सियस, एक्सटेंशन और प्रतिदीप्ति पर 1 मिनट के लिए एनीलिंग। 72 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए माप किए गए थे। सभी नमूनों को तीन बार प्रवर्धित किया गया था और आरटी-क्यूपीसीआर विश्लेषण के लिए औसत मूल्य का उपयोग किया गया था। फ्लेक्सस्टेशन 3 (आणविक उपकरण, सनीवेल, सीए, यूएसए) का उपयोग करके प्रवर्धन डेटा का विश्लेषण किया गया था। IL-4, IL-17, और IFN-ing जीन अभिव्यक्ति को अंतर्जात नियंत्रण (ACTB) के लिए सामान्यीकृत किया गया था। लक्ष्य mRNA के सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तरों की गणना 2-gothtCT विधि का उपयोग करके की गई थी।
RIPA Lysis बफर (एक प्रोटीज और फॉस्फेट इनहिबिटर कॉकटेल युक्त) में एक ऊतक होमोजेनाइज़र का उपयोग करके ऊतकों से कुल प्रोटीन निकाला गया और फिर ऊतक मलबे को हटाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 13,000 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूग किया गया। प्रोटीन के पचास माइक्रोग्राम को प्रति लेन लोड किया गया था, जिसे 10% एसडीएस-पेज द्वारा अलग किया गया था, और फिर एक पीवीडीएफ झिल्ली में स्थानांतरित कर दिया गया था। ट्रिस-बफर सलाइन (टीबीएस) में 5% नॉनफैट सूखे दूध में ब्लॉकिंग किया गया था, जिसमें कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 0.1% ट्वीन 20 था। झिल्ली को खरगोश विरोधी डेकोरिन प्राथमिक एंटीबॉडी (पतला 1: 200; बस्टर, वुहान, चीन) (पतला 1: 200; बायोस, बीजिंग, चीन) के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात रात भर में ऊष्मायन किया गया था और दूसरे दिनों में प्रतिक्रिया व्यक्त की गई थी; माध्यमिक एंटीबॉडी (बकरी एंटी-खरगोश इम्युनोग्लोबुलिन जी 1: 40,000 कमजोर पड़ने पर) के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (बोस्टर, वुहान, चीन) के साथ संयुक्त। एक्स-रे विकिरण के बाद केमिल्यूमिनसेंट झिल्ली पर केमिल्यूमिनसेंस में वृद्धि से पश्चिमी धब्बा संकेतों का पता लगाया गया था। डेंसिटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए, Blots को BandScan सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके स्कैन और मात्रा निर्धारित किया गया था और परिणामों को ट्यूबुलिन इम्युनोरेक्टिविटी के लिए लक्ष्य जीन इम्युनोरेक्टिविटी के अनुपात के रूप में व्यक्त किया गया था।
SPSS16.0 सॉफ्टवेयर पैकेज (SPSS, USA) का उपयोग करके सांख्यिकीय गणना की गई। अध्ययन के दौरान एकत्र किए गए डेटा को ± मानक विचलन (मतलब) एसडी) के रूप में व्यक्त किया गया था और दो समूहों के बीच अंतर को निर्धारित करने के लिए एक-तरफ़ा दोहराए गए उपायों के विश्लेषण (एनोवा) के विश्लेषण का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था। P <0.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था।
इस प्रकार, कशेरुक शरीर में ऑटोलॉगस एनपी को प्रत्यारोपित करके और मैक्रोएनेटोमिकल अवलोकन, एमआरआई विश्लेषण, हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन और आणविक जैविक विश्लेषण करके एमसी के एक पशु मॉडल की स्थापना मानव एमसी के तंत्र का आकलन करने और समझने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बन सकती है। हस्तक्षेप।
इस लेख का हवाला कैसे दें: हान, सी। एट अल। MODIC परिवर्तनों का एक पशु मॉडल काठ की रीढ़ की उप -हड्डी की हड्डी में ऑटोलॉगस न्यूक्लियस पल्पोसस को प्रत्यारोपित करके स्थापित किया गया था। विज्ञान। प्रतिनिधि 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016)।
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