मायोसिन हेवी चेन से परे मानव कंकाल की मांसपेशियों के तंतुओं की विषमता

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कंकाल की मांसपेशी एक विषम ऊतक है जो मुख्य रूप से मायोफाइब्रिल्स से बनी होती है, जिन्हें मनुष्यों में आमतौर पर तीन प्रकारों में वर्गीकृत किया जाता है: एक "धीमा" (प्रकार 1) और दो "तेज़" (प्रकार 2A और 2X)। हालांकि, पारंपरिक मायोफाइब्रिल प्रकारों के बीच और भीतर की विषमता को अभी तक पूरी तरह से समझा नहीं गया है। हमने मानव वास्टस लेटरलिस से क्रमशः 1050 और 1038 व्यक्तिगत मायोफाइब्रिल्स पर ट्रांसक्रिप्टोमिक और प्रोटिओमिक दृष्टिकोण लागू किए। प्रोटिओमिक अध्ययन में पुरुष शामिल थे, और ट्रांसक्रिप्टोमिक अध्ययन में 10 पुरुष और 2 महिलाएं शामिल थीं। मायोसिन हेवी चेन आइसोफॉर्म के अलावा, हमने बहुआयामी इंटरमायोफाइब्रिल परिवर्तनशीलता के स्रोतों के रूप में मेटाबोलिक प्रोटीन, राइबोसोमल प्रोटीन और सेलुलर जंक्शनल प्रोटीन की पहचान की। इसके अलावा, धीमे और तेज़ फाइबर के समूहों की पहचान के बावजूद, हमारे डेटा से पता चलता है कि टाइप 2X फाइबर फेनोटाइपिक रूप से अन्य तेज़-ट्विच फाइबर से अप्रभेद्य हैं। इसके अलावा, मायोसिन हेवी चेन पर आधारित वर्गीकरण नेमालाइन मायोपैथी में मायोफाइबर फेनोटाइप का वर्णन करने के लिए अपर्याप्त है। कुल मिलाकर, हमारे डेटा से पता चलता है कि मायोफाइबर में बहुआयामी विषमता होती है, जिसके भिन्नता के स्रोत मायोसिन हेवी चेन आइसोफॉर्म से कहीं अधिक व्यापक हैं।
कोशिकीय विषमता सभी जैविक प्रणालियों की एक अंतर्निहित विशेषता है, जो कोशिकाओं को ऊतकों और कोशिकाओं की विभिन्न आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए विशिष्ट होने की अनुमति देती है।1 कंकाल की मांसपेशियों के तंतुओं की विषमता का पारंपरिक दृष्टिकोण यह रहा है कि मोटर न्यूरॉन्स एक मोटर इकाई के भीतर तंतु प्रकार को परिभाषित करते हैं, और वह तंतु प्रकार (अर्थात मनुष्यों में टाइप 1, टाइप 2A, और टाइप 2X) मायोसिन हेवी चेन (MYH) आइसोफॉर्म की विशेषताओं द्वारा निर्धारित होता है।2 यह शुरू में उनकी pH ATPase अस्थिरता पर आधारित था,3,4 और बाद में MYH की उनकी आणविक अभिव्यक्ति पर।5 हालांकि, विभिन्न अनुपातों में कई MYH को सह-व्यक्त करने वाले "मिश्रित" तंतुओं की पहचान और बाद में स्वीकृति के साथ, कंकाल की मांसपेशियों के तंतुओं को अलग-अलग तंतु प्रकारों के बजाय एक निरंतरता के रूप में देखा जा रहा है।6 इसके बावजूद, यह क्षेत्र अभी भी मायोफाइबर वर्गीकरण के लिए प्राथमिक वर्गीकारक के रूप में MYH पर बहुत अधिक निर्भर करता है, एक ऐसा दृष्टिकोण जो संभवतः प्रारंभिक कृंतक अध्ययनों की सीमाओं और महत्वपूर्ण पूर्वाग्रहों से प्रभावित है, जिनके MYH अभिव्यक्ति प्रोफाइल और तंतु प्रकारों की श्रेणी मनुष्यों से भिन्न है।2 स्थिति यह इस तथ्य से और भी जटिल हो जाता है कि विभिन्न मानव कंकाल की मांसपेशियों में फाइबर प्रकारों की एक विविध श्रेणी पाई जाती है।7 वास्टस लेटरलिस एक मिश्रित मांसपेशी है जिसमें एक मध्यवर्ती (और इसलिए प्रतिनिधि) MYH अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल होती है।7 इसके अलावा, इसके नमूने लेने में आसानी इसे मनुष्यों में सबसे अच्छी तरह से अध्ययन की गई मांसपेशी बनाती है।
इस प्रकार, शक्तिशाली "ओमिक्स" उपकरणों का उपयोग करके कंकाल की मांसपेशियों के रेशों की विविधता का निष्पक्ष अध्ययन महत्वपूर्ण है, लेकिन साथ ही चुनौतीपूर्ण भी है, जिसका एक कारण कंकाल की मांसपेशियों के रेशों की बहुनाभिकीय प्रकृति है। हालांकि, हाल के वर्षों में विभिन्न तकनीकी प्रगति के कारण ट्रांसक्रिप्टोमिक्स8,9 और प्रोटिओमिक्स10 तकनीकों की संवेदनशीलता में क्रांतिकारी परिवर्तन आया है, जिससे एकल-रेशा रिज़ॉल्यूशन पर कंकाल की मांसपेशियों का विश्लेषण संभव हो पाया है। परिणामस्वरूप, एकल-रेशा विविधता और शोषी उत्तेजनाओं और उम्र बढ़ने के प्रति उनकी प्रतिक्रिया को समझने में महत्वपूर्ण प्रगति हुई है11,12,13,14,15,16,17,18। महत्वपूर्ण बात यह है कि इन तकनीकी प्रगति के नैदानिक ​​अनुप्रयोग भी हैं, जो रोग-संबंधी अनियमितता का अधिक विस्तृत और सटीक विश्लेषण करने में सहायक हैं। उदाहरण के लिए, नेमालाइन मायोपैथी की पैथोफिजियोलॉजी, जो सबसे आम वंशानुगत मांसपेशी रोगों (एमआईएम 605355 और एमआईएम 161800) में से एक है, जटिल और भ्रामक है।19,20 इसलिए, कंकाल की मांसपेशियों के रेशों के अव्यवस्था का बेहतर लक्षण वर्णन इस बीमारी की हमारी समझ में महत्वपूर्ण प्रगति ला सकता है।
हमने मानव बायोप्सी नमूनों से मैन्युअल रूप से पृथक किए गए एकल कंकाल मांसपेशी तंतुओं के ट्रांसक्रिप्टोमिक और प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए विधियाँ विकसित कीं और उन्हें हजारों तंतुओं पर लागू किया, जिससे हमें मानव कंकाल मांसपेशी तंतुओं की कोशिकीय विषमता का अध्ययन करने में सहायता मिली। इस कार्य के दौरान, हमने मांसपेशी तंतुओं के ट्रांसक्रिप्टोमिक और प्रोटिओमिक फेनोटाइपिंग की शक्ति का प्रदर्शन किया और चयापचय, राइबोसोमल और कोशिकीय जंक्शनल प्रोटीन को अंतर-तंतुओं की परिवर्तनशीलता के महत्वपूर्ण स्रोतों के रूप में पहचाना। इसके अलावा, इस प्रोटिओमिक कार्यप्रणाली का उपयोग करते हुए, हमने एकल कंकाल मांसपेशी तंतुओं में नेमाटोड मायोपैथी की नैदानिक ​​प्रासंगिकता का लक्षण वर्णन किया, जिससे MYH के आधार पर तंतु प्रकार से स्वतंत्र गैर-ऑक्सीडेटिव तंतुओं की ओर एक समन्वित बदलाव का पता चला।
मानव कंकाल की मांसपेशियों के तंतुओं की विषमता का अध्ययन करने के लिए, हमने एकल कंकाल की मांसपेशियों के तंतुओं के ट्रांसक्रिप्टोम और प्रोटीओम विश्लेषण को सक्षम करने हेतु दो कार्यप्रवाह विकसित किए (चित्र 1A और पूरक चित्र 1A)। हमने नमूना भंडारण और आरएनए एवं प्रोटीन की अखंडता के संरक्षण से लेकर प्रत्येक दृष्टिकोण के लिए थ्रूपुट को अनुकूलित करने तक, कई कार्यप्रणालीगत चरणों को विकसित और अनुकूलित किया। ट्रांसक्रिप्टोम विश्लेषण के लिए, यह रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के प्रारंभिक चरण में नमूना-विशिष्ट आणविक बारकोड डालकर प्राप्त किया गया, जिससे कुशल डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण के लिए 96 तंतुओं को एकत्रित किया जा सका। पारंपरिक एकल-कोशिका दृष्टिकोणों की तुलना में गहन अनुक्रमण (प्रति तंतु ±1 मिलियन रीड्स) ने ट्रांसक्रिप्टोम डेटा को और समृद्ध किया। 21 प्रोटीओमिक्स के लिए, हमने उच्च थ्रूपुट बनाए रखते हुए प्रोटीओम की गहराई को अनुकूलित करने के लिए टिम्सटीओएफ मास स्पेक्ट्रोमीटर पर डीआईए-पीएएसईएफ डेटा अधिग्रहण के साथ एक छोटे क्रोमैटोग्राफिक ग्रेडिएंट (21 मिनट) का उपयोग किया। 22,23 स्वस्थ कंकाल की मांसपेशियों के तंतुओं की विषमता की जांच करने के लिए, हमने 14 स्वस्थ वयस्क दाताओं से 1,050 व्यक्तिगत तंतुओं के ट्रांसक्रिप्टोम और 5 स्वस्थ वयस्क दाताओं से 1,038 तंतुओं के प्रोटीओम का विश्लेषण किया (पूरक तालिका 1)। इस पत्र में, इन डेटासेट को क्रमशः 1,000-तंतुओं के ट्रांसक्रिप्टोम और प्रोटीओम के रूप में संदर्भित किया गया है। हमारे दृष्टिकोण ने 1,000-तंतुओं के ट्रांसक्रिप्टोमिक और प्रोटीओमिक विश्लेषणों में कुल 27,237 ट्रांसक्रिप्ट और 2,983 प्रोटीन का पता लगाया (चित्र 1ए, पूरक डेटासेट 1-2)। प्रति तंतु 1,000 से अधिक जीन और 50% मान्य मानों के लिए ट्रांसक्रिप्टोमिक और प्रोटीओमिक डेटासेट को फ़िल्टर करने के बाद, ट्रांसक्रिप्टोम और प्रोटीओम में क्रमशः 925 और 974 तंतुओं के लिए जैवसूचना विज्ञान विश्लेषण किए गए। फ़िल्टरिंग के बाद, प्रति फाइबर औसतन 4257 ± 1557 जीन और 2015 ± 234 प्रोटीन (औसत ± मानक विचलन) पाए गए, जिनमें व्यक्तियों के बीच सीमित भिन्नता थी (पूरक चित्र 1B–C, पूरक डेटासेट 3–4)। हालांकि, प्रतिभागियों के बीच व्यक्ति-के-अंदर भिन्नता अधिक स्पष्ट थी, संभवतः अलग-अलग लंबाई और अनुप्रस्थ काट क्षेत्रफल वाले फाइबरों के बीच RNA/प्रोटीन की मात्रा में अंतर के कारण। अधिकांश प्रोटीनों (>2000) के लिए, भिन्नता गुणांक 20% से कम था (पूरक चित्र 1D)। दोनों विधियों से मांसपेशियों के संकुचन के लिए महत्वपूर्ण उच्च अभिव्यक्त संकेतों (जैसे, ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) वाले ट्रांसक्रिप्ट और प्रोटीनों की एक विस्तृत गतिशील श्रेणी को कैप्चर किया जा सका (पूरक चित्र 1E–F)। पहचाने गए अधिकांश लक्षण ट्रांसक्रिप्टोमिक और प्रोटिओमिक डेटासेट के बीच समान थे (पूरक चित्र 1जी), और इन लक्षणों की औसत यूएमआई/एलएफक्यू तीव्रता यथोचित रूप से अच्छी तरह से सहसंबंधित थी (आर = 0.52) (पूरक चित्र 1एच)।
ट्रांसक्रिप्टोमिक्स और प्रोटिओमिक्स वर्कफ़्लो (BioRender.com के साथ बनाया गया)। चित्र BD में MYH7, MYH2 और MYH1 के लिए डायनामिक रेंज कर्व और फाइबर प्रकार निर्धारण के लिए परिकलित थ्रेशहोल्ड दर्शाए गए हैं। चित्र E और F में ट्रांसक्रिप्टोमिक्स और प्रोटिओमिक्स डेटासेट में फाइबर्स में MYH अभिव्यक्ति का वितरण दिखाया गया है। चित्र G और H में MYH-आधारित फाइबर प्रकार के अनुसार रंगीन ट्रांसक्रिप्टोमिक्स और प्रोटिओमिक्स के लिए यूनिफॉर्म डायवर्सिटी एप्रोक्सीमेशन एंड प्रोजेक्शन (UMAP) प्लॉट दर्शाए गए हैं। चित्र I और J में ट्रांसक्रिप्टोमिक्स और प्रोटिओमिक्स डेटासेट में MYH7, MYH2 और MYH1 अभिव्यक्ति दर्शाने वाले फ़ीचर प्लॉट दिखाए गए हैं।
हमने शुरू में ओमिक्स डेटासेट में MYH अभिव्यक्ति की उच्च संवेदनशीलता और गतिशील सीमा का लाभ उठाने वाले एक अनुकूलित दृष्टिकोण का उपयोग करके प्रत्येक फाइबर को MYH-आधारित फाइबर प्रकार निर्दिष्ट करने का लक्ष्य रखा। पिछले अध्ययनों में विभिन्न MYH की अभिव्यक्ति के एक निश्चित प्रतिशत के आधार पर फाइबर को शुद्ध प्रकार 1, प्रकार 2A, प्रकार 2X, या मिश्रित के रूप में वर्गीकृत करने के लिए मनमाने थ्रेशहोल्ड का उपयोग किया गया है11,14,24। हमने एक अलग दृष्टिकोण अपनाया जिसमें प्रत्येक फाइबर की अभिव्यक्ति को उन MYH द्वारा रैंक किया गया जिनका उपयोग हमने फाइबर को वर्गीकृत करने के लिए किया था: MYH7, MYH2, और MYH1, जो क्रमशः प्रकार 1, प्रकार 2A, और प्रकार 2X फाइबर के अनुरूप हैं। फिर हमने प्रत्येक परिणामी वक्र के निचले विभक्ति बिंदु की गणितीय गणना की और प्रत्येक MYH के लिए फाइबर को सकारात्मक (थ्रेशहोल्ड से ऊपर) या नकारात्मक (थ्रेशहोल्ड से नीचे) के रूप में निर्दिष्ट करने के लिए इसे थ्रेशहोल्ड के रूप में उपयोग किया (चित्र 1B-D)। ये आंकड़े दर्शाते हैं कि MYH7 (चित्र 1B) और MYH2 (चित्र 1C) के ऑन/ऑफ एक्सप्रेशन प्रोफाइल प्रोटीन स्तर की तुलना में RNA स्तर पर अधिक स्पष्ट हैं। वास्तव में, प्रोटीन स्तर पर, बहुत कम फाइबर MYH7 को व्यक्त नहीं करते थे, और किसी भी फाइबर में 100% MYH2 एक्सप्रेशन नहीं था। इसके बाद, हमने प्रत्येक डेटासेट में सभी फाइबर को MYH-आधारित फाइबर प्रकार देने के लिए पूर्वनिर्धारित एक्सप्रेशन थ्रेशहोल्ड का उपयोग किया। उदाहरण के लिए, MYH7+/MYH2-/MYH1- फाइबर को टाइप 1 में रखा गया, जबकि MYH7-/MYH2+/MYH1+ फाइबर को मिश्रित टाइप 2A/2X में रखा गया (पूर्ण विवरण के लिए अनुपूरक तालिका 2 देखें)। सभी फाइबर को एक साथ मिलाकर, हमने RNA (चित्र 1E) और प्रोटीन (चित्र 1F) दोनों स्तरों पर MYH-आधारित फाइबर प्रकारों का उल्लेखनीय रूप से समान वितरण देखा, जबकि MYH-आधारित फाइबर प्रकारों की सापेक्ष संरचना व्यक्तियों के अनुसार भिन्न थी, जैसा कि अपेक्षित था (अनुपूरक चित्र 2A)। अधिकांश फाइबर को शुद्ध प्रकार 1 (34-35%) या प्रकार 2A (36-38%) के रूप में वर्गीकृत किया गया था, हालांकि मिश्रित प्रकार 2A/2X फाइबर की भी एक महत्वपूर्ण संख्या पाई गई (16-19%)। एक उल्लेखनीय अंतर यह है कि शुद्ध प्रकार 2X फाइबर केवल RNA स्तर पर ही पाए जा सकते थे, प्रोटीन स्तर पर नहीं, जिससे पता चलता है कि तीव्र MYH अभिव्यक्ति कम से कम आंशिक रूप से प्रतिलेखन के बाद विनियमित होती है।
हमने एंटीबॉडी-आधारित डॉट ब्लॉटिंग का उपयोग करके अपने प्रोटिओमिक्स-आधारित MYH फाइबर टाइपिंग विधि का सत्यापन किया, और दोनों विधियों ने शुद्ध टाइप 1 और टाइप 2A फाइबर की पहचान करने में 100% सहमति प्राप्त की (पूरक चित्र 2B देखें)। हालांकि, प्रोटिओमिक्स-आधारित दृष्टिकोण अधिक संवेदनशील था, मिश्रित फाइबर की पहचान करने में अधिक कुशल था, और प्रत्येक फाइबर में प्रत्येक MYH जीन के अनुपात को निर्धारित करने में भी अधिक प्रभावी था। ये आंकड़े कंकाल की मांसपेशियों के फाइबर प्रकारों को चिह्नित करने के लिए एक वस्तुनिष्ठ, अत्यधिक संवेदनशील ओमिक्स-आधारित दृष्टिकोण के उपयोग की प्रभावशीलता को दर्शाते हैं।
इसके बाद हमने ट्रांसक्रिप्टोमिक्स और प्रोटिओमिक्स द्वारा प्रदान की गई संयुक्त जानकारी का उपयोग करके, मायोफाइबरों को उनके संपूर्ण ट्रांसक्रिप्टोम या प्रोटिओम के आधार पर वस्तुनिष्ठ रूप से वर्गीकृत किया। यूनिफॉर्म मैनिफोल्ड एप्रोक्सीमेशन एंड प्रोजेक्शन (UMAP) विधि का उपयोग करके, आयाम को छह प्रमुख घटकों तक कम करके (पूरक चित्र 3A–B), हम ट्रांसक्रिप्टोम (चित्र 1G) और प्रोटिओम (चित्र 1H) में मायोफाइबरों की परिवर्तनशीलता को देख पाए। विशेष रूप से, ट्रांसक्रिप्टोमिक्स या प्रोटिओमिक्स डेटासेट में मायोफाइबरों को प्रतिभागियों (पूरक चित्र 3C–D) या परीक्षण के दिनों (पूरक चित्र 3E) के आधार पर समूहीकृत नहीं किया गया था, जिससे पता चलता है कि कंकाल की मांसपेशियों के तंतुओं में व्यक्ति-के-अंदर परिवर्तनशीलता व्यक्तियों के बीच परिवर्तनशीलता से अधिक है। UMAP प्लॉट में, "तेज़" और "धीमे" मायोफाइबरों का प्रतिनिधित्व करने वाले दो अलग-अलग समूह उभरे (चित्र 1G–H)। MYH7+ (धीमी) मायोफाइबर UMAP1 के धनात्मक ध्रुव पर समूहित थे, जबकि MYH2+ और MYH1+ (तेज़) मायोफाइबर UMAP1 के ऋणात्मक ध्रुव पर समूहित थे (चित्र 1I–J)। हालांकि, MYH अभिव्यक्ति के आधार पर तेज़-सिकुड़ने वाले फाइबर प्रकारों (अर्थात, टाइप 2A, टाइप 2X, या मिश्रित 2A/2X) के बीच कोई अंतर नहीं किया गया, जिससे पता चलता है कि MYH1 (चित्र 1I–J) या अन्य क्लासिकल 2X मायोफाइबर मार्कर जैसे ACTN3 या MYLK2 (पूरक चित्र 4A–B) की अभिव्यक्ति संपूर्ण ट्रांसक्रिप्टोम या प्रोटीओम पर विचार करते समय विभिन्न मायोफाइबर प्रकारों के बीच अंतर नहीं करती है। इसके अलावा, MYH2 और MYH7 की तुलना में, कुछ ही ट्रांसक्रिप्ट या प्रोटीन MYH1 के साथ धनात्मक रूप से सहसंबंधित थे (पूरक चित्र 4C–H), जिससे पता चलता है कि MYH1 की प्रचुरता मायोफाइबर ट्रांसक्रिप्टोम/प्रोटीओम को पूरी तरह से प्रतिबिंबित नहीं करती है। UMAP स्तर पर तीनों MYH आइसोफॉर्म की मिश्रित अभिव्यक्ति का आकलन करने पर भी समान निष्कर्ष निकले (पूरक चित्र 4I–J)। इस प्रकार, जहाँ 2X फाइबर को केवल MYH मात्रा के आधार पर ट्रांसक्रिप्ट स्तर पर पहचाना जा सकता है, वहीं संपूर्ण ट्रांसक्रिप्टोम या प्रोटीओम पर विचार करने पर MYH1+ फाइबर को अन्य तीव्र फाइबर से अलग नहीं किया जा सकता है।
MYH से परे धीमी फाइबर की विषमता के प्रारंभिक अन्वेषण के रूप में, हमने चार स्थापित धीमी फाइबर प्रकार-विशिष्ट प्रोटीनों का मूल्यांकन किया: TPM3, TNNT1, MYL3 और ATP2A22। ट्रांसक्रिप्टोमिक्स (पूरक चित्र 5A) और प्रोटीओमिक्स (पूरक चित्र 5B) दोनों में, धीमी फाइबर उपप्रकारों ने MYH7 के साथ उच्च, हालांकि पूर्ण नहीं, पियर्सन सहसंबंध दिखाया। ट्रांसक्रिप्टोमिक्स (पूरक चित्र 5C) और प्रोटीओमिक्स (पूरक चित्र 5D) में लगभग 25% और 33% धीमी फाइबर को सभी जीन/प्रोटीन उपप्रकारों द्वारा शुद्ध धीमी फाइबर के रूप में वर्गीकृत नहीं किया गया था। इसलिए, कई जीन/प्रोटीन उपप्रकारों के आधार पर धीमी फाइबर का वर्गीकरण अतिरिक्त जटिलता उत्पन्न करता है, यहां तक ​​कि उन प्रोटीनों के लिए भी जो फाइबर प्रकार-विशिष्ट माने जाते हैं। यह दर्शाता है कि एक ही जीन/प्रोटीन परिवार के आइसोफॉर्म के आधार पर फाइबर का वर्गीकरण कंकाल की मांसपेशियों के फाइबर की वास्तविक विषमता को पर्याप्त रूप से प्रतिबिंबित नहीं कर सकता है।
संपूर्ण ओमिक्स मॉडल के पैमाने पर मानव कंकाल की मांसपेशियों के तंतुओं की फेनोटाइपिक परिवर्तनशीलता का और अधिक अध्ययन करने के लिए, हमने प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) का उपयोग करके डेटा का निष्पक्ष आयामी न्यूनीकरण किया (चित्र 2ए)। यूएमएपी प्लॉट के समान, न तो प्रतिभागी और न ही परीक्षण दिवस ने पीसीए स्तर पर तंतुओं के समूह को प्रभावित किया (पूरक चित्र 6ए-सी)। दोनों डेटासेट में, एमवाईएच-आधारित तंतु प्रकार को पीसी2 द्वारा समझाया गया, जिसमें धीमी गति से सिकुड़ने वाले टाइप 1 तंतुओं का एक समूह और तेज़ गति से सिकुड़ने वाले टाइप 2ए, टाइप 2एक्स और मिश्रित 2ए/2एक्स तंतुओं वाला दूसरा समूह दिखाया गया (चित्र 2ए)। दोनों डेटासेट में, ये दो समूह मिश्रित टाइप 1/2ए तंतुओं की एक छोटी संख्या से जुड़े हुए थे। जैसा कि अपेक्षित था, मुख्य पीसी चालकों के अतिप्रतिनिधित्व विश्लेषण ने पुष्टि की कि पीसी2 संकुचनशील और चयापचय संकेतों द्वारा संचालित था (चित्र 2बी और पूरक चित्र 6डी-ई, पूरक डेटासेट 5-6)। कुल मिलाकर, एमवाईएच-आधारित फाइबर प्रकार पीसी2 के साथ निरंतर भिन्नता को समझाने के लिए पर्याप्त पाया गया, तथाकथित 2एक्स फाइबर को छोड़कर जो फास्ट क्लस्टर के भीतर ट्रांसक्रिप्टोम में वितरित थे।
A. MYH के आधार पर फाइबर प्रकार के अनुसार रंगीन ट्रांसक्रिप्टोम और प्रोटीओम डेटासेट के प्रिंसिपल कंपोनेंट एनालिसिस (PCA) प्लॉट। B. PC2 और PC1 में ट्रांसक्रिप्ट और प्रोटीन ड्राइवर्स का संवर्धन विश्लेषण। सांख्यिकीय विश्लेषण क्लस्टरप्रोफाइलर पैकेज और बेंजामिनी-होचबर्ग समायोजित p-मानों का उपयोग करके किया गया था। C, D. ट्रांसक्रिप्टोम में इंटरसेलुलर आसंजन जीन ऑन्टोलॉजी (GO) शब्दों और प्रोटीओम में कोस्टामेरे GO शब्दों के अनुसार रंगीन PCA प्लॉट। तीर ट्रांसक्रिप्ट और प्रोटीन ड्राइवर्स और उनकी दिशाओं को दर्शाते हैं। E, F. नैदानिक ​​रूप से प्रासंगिक विशेषताओं के यूनिफॉर्म मैनिफोल्ड एप्रोक्सीमेशन एंड प्रोजेक्शन (UMAP) फीचर प्लॉट जो धीमे/तेज फाइबर प्रकार से स्वतंत्र अभिव्यक्ति प्रवणता दर्शाते हैं। G, H. ट्रांसक्रिप्टोम और प्रोटीओम में PC2 और PC1 ड्राइवर्स के बीच सहसंबंध।
अप्रत्याशित रूप से, MYH-आधारित मायोफाइबर प्रकार ने परिवर्तनशीलता (PC2) की केवल दूसरी सबसे उच्च डिग्री की व्याख्या की, जिससे पता चलता है कि MYH-आधारित मायोफाइबर प्रकार (PC1) से असंबंधित अन्य जैविक कारक कंकाल की मांसपेशियों के रेशों की विषमता को नियंत्रित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। PC1 में शीर्ष चालकों के अतिप्रतिनिधित्व विश्लेषण से पता चला कि PC1 में परिवर्तनशीलता मुख्य रूप से ट्रांसक्रिप्टोम में कोशिका-कोशिका आसंजन और राइबोसोम सामग्री, और प्रोटीओम में कोस्टामेर्स और राइबोसोमल प्रोटीन द्वारा निर्धारित होती है (चित्र 2B और पूरक चित्र 6D-E, पूरक डेटा सेट 7)। कंकाल की मांसपेशियों में, कोस्टामेर्स Z-डिस्क को सार्कोलेमा से जोड़ते हैं और बल संचरण और संकेतन में शामिल होते हैं। 25 कोशिका-कोशिका आसंजन (ट्रांसक्रिप्टोम, चित्र 2C) और कोस्टामेर (प्रोटीओम, चित्र 2D) विशेषताओं का उपयोग करके एनोटेटेड PCA प्लॉट ने PC1 में एक मजबूत बाएँ बदलाव दिखाया, जो दर्शाता है कि ये विशेषताएँ कुछ रेशों में समृद्ध हैं।
UMAP स्तर पर मायोफाइबर क्लस्टरिंग की अधिक विस्तृत जांच से पता चला कि अधिकांश विशेषताओं ने मायोफाइबर उपसमूह-विशिष्ट होने के बजाय मायोफाइबर प्रकार-स्वतंत्र MYH-आधारित अभिव्यक्ति प्रवणता प्रदर्शित की। यह निरंतरता कई रोग संबंधी स्थितियों से जुड़े जीनों (चित्र 2E) में देखी गई, जैसे कि CHCHD10 (न्यूरोमस्कुलर रोग), SLIT3 (मांसपेशी शोष), CTDNEP1 (मांसपेशी रोग)। यह निरंतरता प्रोटीओम में भी देखी गई, जिसमें तंत्रिका संबंधी विकारों (UGDH), इंसुलिन सिग्नलिंग (PHIP) और प्रतिलेखन (HIST1H2AB) से जुड़े प्रोटीन शामिल हैं (चित्र 2F)। कुल मिलाकर, ये आंकड़े विभिन्न मायोफाइबरों में फाइबर प्रकार-स्वतंत्र धीमी/तेज ट्विच विषमता में निरंतरता दर्शाते हैं।
दिलचस्प बात यह है कि PC2 में ड्राइवर जीन ने अच्छा ट्रांसक्रिप्टोम-प्रोटीओम सहसंबंध (r = 0.663) दिखाया (चित्र 2G), जिससे पता चलता है कि धीमी और तेज़ गति से सिकुड़ने वाले फाइबर प्रकार, और विशेष रूप से कंकाल की मांसपेशियों के फाइबर के संकुचन और चयापचय संबंधी गुण, ट्रांसक्रिप्शनल रूप से विनियमित होते हैं। हालांकि, PC1 में ड्राइवर जीन ने कोई ट्रांसक्रिप्टोम-प्रोटीओम सहसंबंध नहीं दिखाया (r = -0.027) (चित्र 2H), जिससे पता चलता है कि धीमी/तेज़ गति से सिकुड़ने वाले फाइबर प्रकारों से असंबंधित भिन्नताएं मुख्य रूप से ट्रांसक्रिप्शन के बाद विनियमित होती हैं। चूंकि PC1 में भिन्नताओं को मुख्य रूप से राइबोसोमल जीन ऑन्टोलॉजी शब्दों द्वारा समझाया गया था, और यह देखते हुए कि राइबोसोम प्रोटीन अनुवाद में सक्रिय रूप से भाग लेकर और उसे प्रभावित करके कोशिका में एक महत्वपूर्ण और विशिष्ट भूमिका निभाते हैं,31 हमने आगे इस अप्रत्याशित राइबोसोमल विषमता की जांच करने का निर्णय लिया।
हमने सबसे पहले प्रोटिओमिक्स प्रिंसिपल कंपोनेंट एनालिसिस प्लॉट को GOCC शब्द "साइटोप्लाज्मिक राइबोसोम" में प्रोटीन की सापेक्ष प्रचुरता के अनुसार रंग दिया (चित्र 3A)। हालांकि यह शब्द PC1 के सकारात्मक पक्ष पर समृद्ध है, जिसके परिणामस्वरूप एक छोटा ग्रेडिएंट बनता है, राइबोसोमल प्रोटीन PC1 की दोनों दिशाओं में विभाजन को संचालित करते हैं (चित्र 3A)। PC1 के नकारात्मक पक्ष पर समृद्ध राइबोसोमल प्रोटीन में RPL18, RPS18 और RPS13 शामिल थे (चित्र 3B), जबकि RPL31, RPL35 और RPL38 (चित्र 3C) PC1 के सकारात्मक पक्ष पर मुख्य चालक थे। दिलचस्प बात यह है कि RPL38 और RPS13 अन्य ऊतकों की तुलना में कंकाल की मांसपेशियों में अत्यधिक व्यक्त किए गए थे (पूरक चित्र 7A)। PC1 में ये विशिष्ट राइबोसोमल संकेत ट्रांसक्रिप्टोम में नहीं देखे गए (पूरक चित्र 7B), जो पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन को इंगित करता है।
A. प्रोटिओम में साइटोप्लाज्मिक राइबोसोमल जीन ऑन्टोलॉजी (GO) शब्दों के अनुसार रंगीन प्रिंसिपल कंपोनेंट एनालिसिस (PCA) प्लॉट। तीर PCA प्लॉट में प्रोटीन-मध्यस्थता वाले बदलाव की दिशा दर्शाते हैं। रेखा की लंबाई किसी दिए गए प्रोटीन के लिए प्रिंसिपल कंपोनेंट स्कोर के अनुरूप है। B, C. RPS13 और RPL38 के लिए PCA फीचर प्लॉट। D. साइटोप्लाज्मिक राइबोसोमल प्रोटीन का अनसुपरवाइज्ड पदानुक्रमित क्लस्टरिंग विश्लेषण। E. 80S राइबोसोम (PDB: 4V6X) का संरचनात्मक मॉडल, जो कंकाल की मांसपेशियों के तंतुओं में अलग-अलग मात्रा में पाए जाने वाले राइबोसोमल प्रोटीन को दर्शाता है। F. mRNA निकास चैनल के पास स्थित अलग-अलग स्टोइकोमेट्री वाले राइबोसोमल प्रोटीन।
राइबोसोमल विषमता और विशिष्टीकरण की अवधारणाएँ पहले भी प्रस्तावित की जा चुकी हैं, जिसके अनुसार विशिष्ट राइबोसोम उपसमूहों (राइबोसोमल विषमता) की उपस्थिति विशिष्ट mRNA प्रतिलेख पूलों34 (राइबोसोम विशिष्टीकरण) के चयनात्मक अनुवाद के माध्यम से विभिन्न ऊतकों32 और कोशिकाओं33 में प्रोटीन अनुवाद को प्रत्यक्ष रूप से प्रभावित कर सकती है। कंकाल की मांसपेशियों के तंतुओं में सह-अभिव्यक्त राइबोसोमल प्रोटीन के उपसमूहों की पहचान करने के लिए, हमने प्रोटीओम में राइबोसोमल प्रोटीन का एक अनियंत्रित पदानुक्रमित क्लस्टरिंग विश्लेषण किया (चित्र 3D, पूरक डेटा सेट 8)। जैसा कि अपेक्षित था, राइबोसोमल प्रोटीन MYH के आधार पर तंतु प्रकार के अनुसार क्लस्टर नहीं हुए। हालाँकि, हमने राइबोसोमल प्रोटीन के तीन विशिष्ट क्लस्टर की पहचान की; पहला क्लस्टर (ribosomal_cluster_1) RPL38 के साथ सह-विनियमित है और इसलिए सकारात्मक PC1 प्रोफ़ाइल वाले तंतुओं में इसकी अभिव्यक्ति बढ़ जाती है। दूसरा क्लस्टर (राइबोसोमल_क्लस्टर_2) RPS13 के साथ सह-विनियमित है और नकारात्मक PC1 प्रोफ़ाइल वाले फाइबर में उच्च स्तर पर पाया जाता है। तीसरा क्लस्टर (राइबोसोमल_क्लस्टर_3) कंकाल की मांसपेशियों के फाइबर में समन्वित विभेदक अभिव्यक्ति नहीं दिखाता है और इसे कंकाल की मांसपेशियों का "कोर" राइबोसोमल प्रोटीन माना जा सकता है। राइबोसोमल क्लस्टर 1 और 2 दोनों में ऐसे राइबोसोमल प्रोटीन होते हैं जिन्हें पहले वैकल्पिक अनुवाद (जैसे, RPL10A, RPL38, RPS19 और RPS25) को विनियमित करने और विकास को कार्यात्मक रूप से प्रभावित करने (जैसे, RPL10A, RPL38) के लिए दिखाया गया है।34,35,36,37,38 PCA परिणामों के अनुरूप, फाइबर में इन राइबोसोमल प्रोटीन का देखा गया विषम प्रतिनिधित्व भी निरंतरता दर्शाता है (पूरक चित्र 7C)।
राइबोसोम के भीतर विषम राइबोसोमल प्रोटीनों की स्थिति को देखने के लिए, हमने मानव 80S राइबोसोम (प्रोटीन डेटा बैंक: 4V6X) के संरचनात्मक मॉडल का उपयोग किया (चित्र 3E)। विभिन्न राइबोसोमल समूहों से संबंधित राइबोसोमल प्रोटीनों को अलग करने के बाद, उनकी स्थितियाँ एक दूसरे के अनुरूप नहीं थीं, जिससे पता चलता है कि हमारा दृष्टिकोण राइबोसोम के कुछ क्षेत्रों/अंशों के संवर्धन में विफल रहा। हालांकि, दिलचस्प बात यह है कि समूह 2 में बड़े सबयूनिट प्रोटीनों का अनुपात समूह 1 और 3 की तुलना में कम था (पूरक चित्र 7D)। हमने देखा कि कंकाल की मांसपेशियों के तंतुओं में परिवर्तित स्टोइकोमेट्री वाले प्रोटीन मुख्य रूप से राइबोसोम की सतह पर स्थित थे (चित्र 3E), जो विभिन्न mRNA आबादी में आंतरिक राइबोसोम प्रवेश स्थल (IRES) तत्वों के साथ परस्पर क्रिया करने और इस प्रकार चयनात्मक अनुवाद का समन्वय करने की उनकी क्षमता के अनुरूप है। 40, 41 इसके अलावा, कंकाल की मांसपेशियों के तंतुओं में परिवर्तित स्टोइकोमेट्री वाले कई प्रोटीन mRNA निकास सुरंग (चित्र 3F) जैसे कार्यात्मक क्षेत्रों के पास स्थित थे, जो विशिष्ट पेप्टाइडों के अनुवादकीय विस्तार और अवरोध को चुनिंदा रूप से नियंत्रित करते हैं। 42 संक्षेप में, हमारे डेटा से पता चलता है कि कंकाल की मांसपेशियों के राइबोसोमल प्रोटीन की स्टोइकोमेट्री में विषमता पाई जाती है, जिसके परिणामस्वरूप कंकाल की मांसपेशियों के तंतुओं के बीच अंतर होता है।
इसके बाद हमने तीव्र और धीमी गति से सिकुड़ने वाले तंतुओं के विशिष्ट संकेतों की पहचान करने और उनके प्रतिलेखन विनियमन की प्रक्रियाओं का पता लगाने का प्रयास किया। दो डेटासेटों में UMAP द्वारा परिभाषित तीव्र और धीमी गति से सिकुड़ने वाले तंतुओं के समूहों की तुलना करने पर (चित्र 1G–H और 4A–B), प्रतिलेखन और प्रोटीन विश्लेषणों से क्रमशः 1366 और 804 भिन्न-भिन्न प्रचुर मात्रा में पाए जाने वाले लक्षण प्राप्त हुए (चित्र 4A–B, पूरक डेटासेट 9–12)। हमने सार्कोमेयर (जैसे, ट्रॉपोमायोसिन और ट्रोपोनिन), उत्तेजना-संकुचन युग्मन (SERCA आइसोफॉर्म) और ऊर्जा चयापचय (जैसे, ALDOA और CKB) से संबंधित संकेतों में अपेक्षित अंतर देखे। इसके अतिरिक्त, प्रोटीन यूबिक्विटिनेशन को विनियमित करने वाले प्रतिलेख और प्रोटीन तीव्र और धीमी गति से सिकुड़ने वाले तंतुओं में भिन्न-भिन्न रूप से व्यक्त किए गए (जैसे, USP54, SH3RF2, USP28 और USP48) (चित्र 4A–B)। इसके अलावा, माइक्रोबियल प्रोटीन जीन RP11-451G4.2 (DWORF), जिसे पहले भेड़ की मांसपेशियों के रेशों के विभिन्न प्रकारों में भिन्न रूप से व्यक्त किया गया था43 और हृदय की मांसपेशियों में SERCA गतिविधि को बढ़ाता है44, धीमी कंकाल की मांसपेशियों के रेशों में काफी अधिक मात्रा में पाया गया (चित्र 4A)। इसी प्रकार, व्यक्तिगत रेशे के स्तर पर, ज्ञात संकेतों जैसे कि चयापचय-संबंधी लैक्टेट डीहाइड्रोजनेज आइसोफॉर्म (LDHA और LDHB, चित्र 4C और पूरक चित्र 8A)45,46 के साथ-साथ पहले से अज्ञात रेशे-प्रकार-विशिष्ट संकेतों (जैसे IRX3, USP54, USP28 और DPYSL3) में महत्वपूर्ण अंतर देखे गए (चित्र 4C)। ट्रांसक्रिप्टोमिक और प्रोटिओमिक डेटासेट के बीच भिन्न रूप से व्यक्त विशेषताओं का महत्वपूर्ण ओवरलैप था (पूरक चित्र 8B), साथ ही सार्कोमेयर विशेषताओं की अधिक स्पष्ट भिन्न अभिव्यक्ति द्वारा संचालित फोल्ड परिवर्तन सहसंबंध भी था (पूरक चित्र 8C)। विशेष रूप से, कुछ सिग्नेचर (जैसे यूएसपी28, यूएसपी48, गोल्गा4, एकेएपी13) ने केवल प्रोटिओमिक स्तर पर मजबूत पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन दिखाया और धीमी/तेज ट्विच फाइबर प्रकार-विशिष्ट अभिव्यक्ति प्रोफाइल थे (पूरक चित्र 8सी)।
चित्र 1G–H में यूनिफॉर्म मैनिफोल्ड एप्रोक्सीमेशन एंड प्रोजेक्शन (UMAP) प्लॉट द्वारा पहचाने गए धीमे और तेज़ क्लस्टरों की तुलना करने वाले ज्वालामुखी प्लॉट (A और B) दिखाए गए हैं। रंगीन बिंदु उन ट्रांसक्रिप्ट या प्रोटीन को दर्शाते हैं जो FDR < 0.05 पर महत्वपूर्ण रूप से भिन्न हैं, और गहरे बिंदु उन ट्रांसक्रिप्ट या प्रोटीन को दर्शाते हैं जो लॉग परिवर्तन > 1 पर महत्वपूर्ण रूप से भिन्न हैं। दो-तरफ़ा सांख्यिकीय विश्लेषण DESeq2 वाल्ड परीक्षण का उपयोग करके बेंजामिनी-होचबर्ग समायोजित p मानों (ट्रांसक्रिप्टोमिक्स) के साथ या अनुभवजन्य बायेसियन विश्लेषण के साथ लिम्मा रैखिक मॉडल विधि का उपयोग करके, जिसके बाद कई तुलनाओं के लिए बेंजामिनी-होचबर्ग समायोजन किया गया (प्रोटीओमिक्स) किया गया। चित्र C धीमे और तेज़ फाइबर के बीच चयनित भिन्न रूप से व्यक्त जीन या प्रोटीन के सिग्नेचर प्लॉट दिखाता है। चित्र D महत्वपूर्ण रूप से भिन्न रूप से व्यक्त ट्रांसक्रिप्ट और प्रोटीन का संवर्धन विश्लेषण दिखाता है। ओवरलैपिंग मान दोनों डेटासेट में समृद्ध हैं, ट्रांसक्रिप्टोम मान केवल ट्रांसक्रिप्टोम में समृद्ध हैं, और प्रोटीओम मान केवल प्रोटीओम में समृद्ध हैं। सांख्यिकीय विश्लेषण क्लस्टरप्रोफाइलर पैकेज का उपयोग करके बेंजामिनी-होचबर्ग समायोजित पी-मानों के साथ किया गया। E. SCENIC द्वारा व्युत्पन्न नियामक विशिष्टता स्कोर और फाइबर प्रकारों के बीच विभेदक mRNA अभिव्यक्ति के आधार पर SCENIC द्वारा पहचाने गए फाइबर प्रकार-विशिष्ट प्रतिलेखन कारक। F. धीमी और तेज फाइबर के बीच विभेदक रूप से व्यक्त चयनित प्रतिलेखन कारकों का प्रोफाइलिंग।
इसके बाद हमने विभेदक रूप से निरूपित जीनों और प्रोटीनों का अतिप्रतिनिधित्व विश्लेषण किया (चित्र 4D, पूरक डेटा सेट 13)। दो डेटासेटों के बीच भिन्न विशेषताओं के लिए मार्ग संवर्धन ने अपेक्षित अंतरों को प्रकट किया, जैसे कि फैटी एसिड β-ऑक्सीकरण और कीटोन चयापचय प्रक्रियाएं (धीमे तंतु), मायोफिलामेंट/मांसपेशी संकुचन (क्रमशः तेज और धीमे तंतु), और कार्बोहाइड्रेट अपचय प्रक्रियाएं (तेज तंतु)। सेरीन/थ्रेओनीन प्रोटीन फॉस्फेट गतिविधि भी तेज तंतुओं में बढ़ी हुई थी, जो नियामक और उत्प्रेरक फॉस्फेट उप-इकाइयों (PPP3CB, PPP1R3D, और PPP1R3A) जैसी विशेषताओं द्वारा संचालित थी, जो ग्लाइकोजन चयापचय को विनियमित करने के लिए जानी जाती हैं (47) (पूरक चित्र 8D-E)। अन्य मार्ग जो तीव्र तंतुओं से समृद्ध थे, उनमें प्रोटीओम में प्रसंस्करण (पी-) निकाय (YTHDF3, TRIM21, LSM2) (पूरक चित्र 8F) शामिल थे, जो संभावित रूप से उत्तर-प्रतिलेखन विनियमन (48) में शामिल थे, और ट्रांसक्रिप्टोम में प्रतिलेखन कारक गतिविधि (SREBF1, RXRG, RORA) (पूरक चित्र 8G) शामिल थे। धीमे तंतु ऑक्सीडोरडक्टेस गतिविधि (BDH1, DCXR, TXN2) (पूरक चित्र 8H), एमाइड बंधन (CPTP, PFDN2, CRYAB) (पूरक चित्र 8I), बाह्यकोशिकीय मैट्रिक्स (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (पूरक चित्र 8J), और रिसेप्टर-लिगैंड गतिविधि (FNDC5, SPX, NENF) (पूरक चित्र 8K) से समृद्ध थे।
धीमी/तेज़ मांसपेशी तंतुओं के प्रकार की विशेषताओं के अंतर्निहित प्रतिलेखन विनियमन की गहन जानकारी प्राप्त करने के लिए, हमने SCENIC49 (पूरक डेटा सेट 14) का उपयोग करके प्रतिलेखन कारक संवर्धन विश्लेषण किया। कई प्रतिलेखन कारक तेज़ और धीमी मांसपेशी तंतुओं के बीच महत्वपूर्ण रूप से समृद्ध पाए गए (चित्र 4E)। इसमें MAFA जैसे प्रतिलेखन कारक शामिल थे, जिसे पहले तेज़ मांसपेशी तंतुओं के विकास से जोड़ा गया था,50 साथ ही कई ऐसे प्रतिलेखन कारक भी शामिल थे जो पहले मांसपेशी तंतु प्रकार-विशिष्ट जीन कार्यक्रमों से संबंधित नहीं थे। इनमें से, PITX1, EGR1 और MYF6 तेज़ मांसपेशी तंतुओं में सबसे अधिक समृद्ध प्रतिलेखन कारक थे (चित्र 4E)। इसके विपरीत, ZSCAN30 और EPAS1 (जिसे HIF2A के नाम से भी जाना जाता है) धीमी मांसपेशी तंतुओं में सबसे अधिक समृद्ध प्रतिलेखन कारक थे (चित्र 4E)। इसके अनुरूप, MAFA तेज़ मांसपेशी तंतुओं से संबंधित UMAP क्षेत्र में उच्च स्तर पर व्यक्त किया गया था, जबकि EPAS1 का अभिव्यक्ति पैटर्न विपरीत था (चित्र 4F)।
ज्ञात प्रोटीन-कोडिंग जीनों के अलावा, कई गैर-कोडिंग आरएनए बायोटाइप हैं जो मानव विकास और रोग के नियमन में शामिल हो सकते हैं। 51, 52 ट्रांसक्रिप्टोम डेटासेट में, कई गैर-कोडिंग आरएनए फाइबर प्रकार विशिष्टता प्रदर्शित करते हैं (चित्र 5ए और पूरक डेटासेट 15), जिसमें LINC01405 भी शामिल है, जो धीमी फाइबर के लिए अत्यधिक विशिष्ट है और माइटोकॉन्ड्रियल मायोपैथी वाले रोगियों की मांसपेशियों में कम होने की सूचना है। 53 इसके विपरीत, RP11-255P5.3, जो lnc-ERCC5-5 जीन (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54 के अनुरूप है, तीव्र फाइबर प्रकार विशिष्टता प्रदर्शित करता है। LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) और RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) दोनों कंकाल की मांसपेशियों के लिए विशिष्टता प्रदर्शित करते हैं (पूरक चित्र 9A–B) और इनके 1 Mb जीनोमिक क्षेत्र में कोई ज्ञात संकुचनशील जीन नहीं हैं, जिससे पता चलता है कि ये आस-पास के संकुचनशील जीनों को नियंत्रित करने के बजाय फाइबर प्रकारों को नियंत्रित करने में एक विशेष भूमिका निभाते हैं। LINC01405 और RP11-255P5.3 के क्रमशः धीमे/तेज़ फाइबर प्रकार-विशिष्ट अभिव्यक्ति प्रोफाइल की पुष्टि RNAscope का उपयोग करके की गई (चित्र 5B–C)।
A. धीमी और तीव्र गति वाली मांसपेशी तंतुओं में गैर-कोडिंग RNA प्रतिलेखों का महत्वपूर्ण विनियमन होता है। B. प्रतिनिधि RNAscope छवियां LINC01405 और RP11-255P5.3 की धीमी और तीव्र गति वाली तंतु प्रकार विशिष्टता को दर्शाती हैं। स्केल बार = 50 μm। C. RNAscope द्वारा निर्धारित मायोफाइबर प्रकार-विशिष्ट गैर-कोडिंग RNA अभिव्यक्ति का मात्रात्मक विश्लेषण (n = 3 स्वतंत्र व्यक्तियों से बायोप्सी, प्रत्येक व्यक्ति के भीतर तीव्र और धीमी मांसपेशी तंतुओं की तुलना)। सांख्यिकीय विश्लेषण दो-पूंछ वाले स्टूडेंट के t-परीक्षण का उपयोग करके किया गया था। बॉक्स प्लॉट माध्यिका और प्रथम और तृतीय चतुर्थक को दर्शाते हैं, जिसमें व्हिस्कर न्यूनतम और अधिकतम मानों को इंगित करते हैं। D. डी नोवो माइक्रोबियल प्रोटीन पहचान कार्यप्रवाह (BioRender.com के साथ बनाया गया)। E. माइक्रोबियल प्रोटीन LINC01405_ORF408:17441:17358 विशेष रूप से धीमी कंकाल मांसपेशी तंतुओं में व्यक्त होता है (n=5 स्वतंत्र प्रतिभागियों से बायोप्सी, प्रत्येक प्रतिभागी में तेज और धीमी मांसपेशी तंतुओं की तुलना करते हुए)। सांख्यिकीय विश्लेषण लिम रैखिक मॉडल विधि और अनुभवजन्य बायेसियन दृष्टिकोण के संयोजन से किया गया, जिसके बाद पी-मान समायोजन के साथ बहु-तुलना के लिए बेंजामिनी-होचबर्ग विधि का प्रयोग किया गया। बॉक्स प्लॉट माध्यिका, प्रथम और तृतीय चतुर्थक दर्शाते हैं, जिसमें व्हिस्कर अधिकतम/न्यूनतम मानों को इंगित करते हैं।
हाल ही में हुए अध्ययनों से पता चला है कि कई संभावित गैर-कोडिंग ट्रांसक्रिप्ट, ट्रांसक्राइब्ड माइक्रोबियल प्रोटीन को एनकोड करते हैं, जिनमें से कुछ मांसपेशियों के कार्य को नियंत्रित करते हैं। 44, 55 संभावित फाइबर प्रकार विशिष्टता वाले माइक्रोबियल प्रोटीन की पहचान करने के लिए, हमने 1000 फाइबर ट्रांसक्रिप्टोम डेटासेट में पाए गए गैर-कोडिंग ट्रांसक्रिप्ट (n = 305) के अनुक्रमों वाली एक कस्टम FASTA फ़ाइल का उपयोग करके अपने 1000 फाइबर प्रोटीओम डेटासेट में खोज की (चित्र 5D)। हमने 22 अलग-अलग ट्रांसक्रिप्ट से 197 माइक्रोबियल प्रोटीन की पहचान की, जिनमें से 71 धीमी और तेज़ कंकाल मांसपेशी फाइबर के बीच भिन्न रूप से विनियमित थे (पूरक चित्र 9C और पूरक डेटा सेट 16)। LINC01405 के लिए, तीन माइक्रोबियल प्रोटीन उत्पादों की पहचान की गई, जिनमें से एक ने अपने ट्रांसक्रिप्ट के समान धीमी फाइबर विशिष्टता दिखाई (चित्र 5E और पूरक चित्र 9D)। इस प्रकार, हमने LINC01405 को धीमी कंकाल मांसपेशी फाइबर के लिए विशिष्ट माइक्रोबियल प्रोटीन को एनकोड करने वाले जीन के रूप में पहचाना।
हमने व्यक्तिगत मांसपेशी तंतुओं के व्यापक प्रोटिओमिक लक्षण वर्णन के लिए एक व्यापक कार्यप्रणाली विकसित की और स्वस्थ अवस्थाओं में तंतुओं की विषमता के नियामकों की पहचान की। हमने इस कार्यप्रणाली का उपयोग यह समझने के लिए किया कि नेमालाइन मायोपैथी कंकाल की मांसपेशी तंतुओं की विषमता को कैसे प्रभावित करती है। नेमालाइन मायोपैथी वंशानुगत मांसपेशी रोग हैं जो मांसपेशियों की कमजोरी का कारण बनते हैं और प्रभावित बच्चों में श्वसन संकट, स्कोलियोसिस और अंगों की सीमित गतिशीलता सहित कई जटिलताएं उत्पन्न करते हैं। 19,20 आमतौर पर, नेमालाइन मायोपैथी में, एक्टिन अल्फा 1 (ACTA1) जैसे जीन में रोगजनक भिन्नता के परिणामस्वरूप धीमी गति से सिकुड़ने वाले तंतुओं की संरचना में प्रधानता होती है, हालांकि यह प्रभाव विषम होता है। एक उल्लेखनीय अपवाद ट्रोपोनिन T1 नेमालाइन मायोपैथी (TNNT1) है, जिसमें तीव्र गति से सिकुड़ने वाले तंतुओं की प्रधानता होती है। इस प्रकार, नेमालाइन मायोपैथी में देखी गई कंकाल की मांसपेशी तंतुओं की अनियमितता के अंतर्निहित विषमता की बेहतर समझ इन रोगों और तंतुओं के प्रकार के बीच जटिल संबंध को सुलझाने में मदद कर सकती है।
स्वस्थ नियंत्रण समूह (प्रत्येक समूह में n=3) की तुलना में, ACTA1 और TNNT1 जीन में उत्परिवर्तन वाले नेमालाइन मायोपैथी रोगियों से पृथक किए गए मायोफाइबरों में स्पष्ट मायोफाइबर शोष या विकृति देखी गई (चित्र 6A, अनुपूरक तालिका 3)। उपलब्ध सामग्री की सीमित मात्रा के कारण, इससे प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण तकनीकी चुनौतियाँ उत्पन्न हुईं। इसके बावजूद, हम 272 कंकालीय मायोफाइबरों में 2485 प्रोटीन का पता लगाने में सक्षम थे। प्रति फाइबर कम से कम 1000 मात्रा निर्धारित प्रोटीनों को फ़िल्टर करने के बाद, 250 फाइबरों को आगे के जैवसूचना विश्लेषण के लिए चुना गया। फ़िल्टरिंग के बाद, प्रति फाइबर औसतन 1573 ± 359 प्रोटीनों की मात्रा निर्धारित की गई (अनुपूरक चित्र 10A, अनुपूरक डेटा सेट 17-18)। उल्लेखनीय रूप से, फाइबर के आकार में महत्वपूर्ण कमी के बावजूद, नेमालाइन मायोपैथी रोगी नमूनों की प्रोटिओम गहराई में केवल मामूली कमी आई। इसके अलावा, हमारे अपने FASTA फ़ाइलों (गैर-कोडिंग ट्रांसक्रिप्ट सहित) का उपयोग करके इन डेटा को संसाधित करने से हमें नेमालाइन मायोपैथी रोगियों के कंकाल की मांसपेशियों में पाँच माइक्रोबियल प्रोटीन की पहचान करने में मदद मिली (पूरक डेटा सेट 19)। प्रोटीओम की गतिशील सीमा काफी व्यापक थी, और नियंत्रण समूह में कुल प्रोटीन पिछले 1000-फाइबर प्रोटीओम विश्लेषण के परिणामों के साथ अच्छी तरह से मेल खाते थे (पूरक चित्र 10B-C)।
A. सूक्ष्मदर्शी चित्र जो ACTA1 और TNNT1 नेमालाइन मायोपैथी (NM) में MYH के आधार पर फाइबर शोष या विकृति तथा विभिन्न फाइबर प्रकारों की प्रधानता दर्शाते हैं। स्केल बार = 100 μm। ACTA1 और TNNT1 रोगियों में रंगाई की पुनरुत्पादकता सुनिश्चित करने के लिए, प्रतिनिधि चित्र चुनने से पहले तीन रोगी बायोप्सी को दो से तीन बार (प्रति मामले चार खंड) रंगा गया। B. MYH के आधार पर प्रतिभागियों में फाइबर प्रकार का अनुपात। C. नेमालाइन मायोपैथी वाले रोगियों और नियंत्रणों में कंकाल की मांसपेशियों के फाइबर का प्रमुख घटक विश्लेषण (PCA) प्लॉट। D. नेमालाइन मायोपैथी वाले रोगियों और नियंत्रणों से कंकाल की मांसपेशियों के फाइबर को चित्र 2 में विश्लेषण किए गए 1000 फाइबर से निर्धारित PCA प्लॉट पर प्रक्षेपित किया गया है। उदाहरण के लिए, ACTA1 और TNNT1 नेमालाइन मायोपैथी वाले प्रतिभागियों और नियंत्रणों के बीच तथा ACTA1 और TNNT1 नेमालाइन मायोपैथी वाले प्रतिभागियों के बीच अंतर की तुलना करने वाले ज्वालामुखी प्लॉट। रंगीन वृत्त उन प्रोटीनों को दर्शाते हैं जिनमें π < 0.05 पर महत्वपूर्ण अंतर था, और गहरे बिंदु उन प्रोटीनों को दर्शाते हैं जिनमें FDR < 0.05 पर महत्वपूर्ण अंतर था। सांख्यिकीय विश्लेषण लिम्मा रैखिक मॉडल विधि और अनुभवजन्य बायेसियन विधियों का उपयोग करके किया गया, जिसके बाद बेंजामिनी-होचबर्ग विधि का उपयोग करके एकाधिक तुलनाओं के लिए p-मान समायोजन किया गया। H. संपूर्ण प्रोटीओम और टाइप 1 और 2A फाइबर में महत्वपूर्ण रूप से भिन्न रूप से व्यक्त प्रोटीनों का संवर्धन विश्लेषण। सांख्यिकीय विश्लेषण क्लस्टरप्रोफाइलर पैकेज और बेंजामिनी-होचबर्ग समायोजित p-मानों का उपयोग करके किया गया। I, J. बाह्यकोशिकीय मैट्रिक्स और माइटोकॉन्ड्रियल जीन ऑन्टोलॉजी (GO) शब्दों द्वारा रंगीन प्रमुख घटक विश्लेषण (PCA) प्लॉट।
क्योंकि नेमालाइन मायोपैथी कंकाल की मांसपेशियों में MYH-व्यक्त करने वाले मायोफाइबर प्रकारों के अनुपात को प्रभावित कर सकती है,19,20 इसलिए हमने सबसे पहले नेमालाइन मायोपैथी से पीड़ित रोगियों और नियंत्रण समूह में MYH-व्यक्त करने वाले मायोफाइबर प्रकारों की जांच की। हमने 1000 मायोफाइबर परख (पूरक चित्र 10D–E) के लिए पहले वर्णित एक निष्पक्ष विधि का उपयोग करके मायोफाइबर प्रकार का निर्धारण किया और फिर से शुद्ध 2X मायोफाइबर की पहचान करने में विफल रहे (चित्र 6B)। हमने मायोफाइबर प्रकार पर नेमालाइन मायोपैथी का एक विषम प्रभाव देखा, क्योंकि ACTA1 उत्परिवर्तन वाले दो रोगियों में टाइप 1 मायोफाइबर का अनुपात बढ़ा हुआ था, जबकि TNNT1 नेमालाइन मायोपैथी वाले दो रोगियों में टाइप 1 मायोफाइबर का अनुपात घटा हुआ था (चित्र 6B)। वास्तव में, ACTA1-नेमालाइन मायोपैथी में MYH2 और फास्ट ट्रोपोनिन आइसोफॉर्म (TNNC2, TNNI2 और TNNT3) की अभिव्यक्ति कम हो गई थी, जबकि TNNT1-नेमालाइन मायोपैथी में MYH7 की अभिव्यक्ति कम हो गई थी (पूरक चित्र 11A)। यह नेमालाइन मायोपैथी में विषम मायोफाइबर प्रकार स्विचिंग की पिछली रिपोर्टों के अनुरूप है।19,20 हमने इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा इन परिणामों की पुष्टि की और पाया कि ACTA1-नेमालाइन मायोपैथी वाले रोगियों में टाइप 1 मायोफाइबर की प्रधानता थी, जबकि TNNT1-नेमालाइन मायोपैथी वाले रोगियों में इसके विपरीत पैटर्न था (चित्र 6A)।
एकल-फाइबर प्रोटीओम स्तर पर, ACTA1 और TNNT1 नेमालाइन मायोपैथी रोगियों के कंकाल की मांसपेशी फाइबर, अधिकांश नियंत्रण फाइबर के साथ क्लस्टर हुए, जिसमें TNNT1 नेमालाइन मायोपैथी फाइबर आमतौर पर सबसे गंभीर रूप से प्रभावित थे (चित्र 6C)। यह विशेष रूप से तब स्पष्ट हुआ जब प्रत्येक रोगी के लिए स्यूडो-इन्फ्लेटेड फाइबर के प्रिंसिपल कंपोनेंट एनालिसिस (PCA) प्लॉट बनाए गए, जिसमें TNNT1 नेमालाइन मायोपैथी रोगी 2 और 3 नियंत्रण नमूनों से सबसे दूर दिखाई दिए (पूरक चित्र 11B, पूरक डेटा सेट 20)। मायोपैथी रोगियों के फाइबर की तुलना स्वस्थ फाइबर से कैसे की जाती है, इसे बेहतर ढंग से समझने के लिए, हमने स्वस्थ वयस्क प्रतिभागियों के 1,000 फाइबर के प्रोटीओमिक विश्लेषण से प्राप्त विस्तृत जानकारी का उपयोग किया। हमने मायोपैथी डेटासेट (ACTA1 और TNNT1 नेमालाइन मायोपैथी रोगी और नियंत्रण) के फाइबर को 1000-फाइबर प्रोटीओमिक विश्लेषण से प्राप्त PCA प्लॉट पर प्रक्षेपित किया (चित्र 6D)। नियंत्रण तंतुओं में PC2 के अनुदिश MYH तंतुओं के प्रकारों का वितरण 1000 तंतुओं के प्रोटिओमिक विश्लेषण से प्राप्त तंतुओं के वितरण के समान था। हालांकि, नेमालाइन मायोपैथी के रोगियों में अधिकांश तंतु PC2 के नीचे की ओर स्थानांतरित हो गए, जो स्वस्थ तीव्र-सिकुड़न वाले तंतुओं के साथ ओवरलैप करते थे, चाहे उनका मूल MYH तंतु प्रकार कुछ भी हो। इस प्रकार, यद्यपि ACTA1 नेमालाइन मायोपैथी वाले रोगियों ने MYH-आधारित विधियों का उपयोग करके मात्रा निर्धारित करने पर टाइप 1 तंतुओं की ओर बदलाव दिखाया, ACTA1 नेमालाइन मायोपैथी और TNNT1 नेमालाइन मायोपैथी दोनों ने कंकाल की मांसपेशियों के तंतुओं के प्रोटिओम को तीव्र-सिकुड़न वाले तंतुओं की ओर स्थानांतरित कर दिया।
इसके बाद हमने प्रत्येक रोगी समूह की तुलना स्वस्थ नियंत्रणों से की और ACTA1 और TNNT1 नेमालाइन मायोपैथी में क्रमशः 256 और 552 भिन्न रूप से व्यक्त प्रोटीन की पहचान की (चित्र 6E–G और पूरक चित्र 11C, पूरक डेटा सेट 21)। जीन संवर्धन विश्लेषण से माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन में समन्वित कमी का पता चला (चित्र 6H–I, पूरक डेटा सेट 22)। आश्चर्यजनक रूप से, ACTA1 और TNNT1 नेमालाइन मायोपैथी में फाइबर प्रकारों की भिन्न प्रधानता के बावजूद, यह कमी MYH-आधारित फाइबर प्रकार से पूरी तरह स्वतंत्र थी (चित्र 6H और पूरक चित्र 11D–I, पूरक डेटा सेट 23)। ACTA1 या TNNT1 नेमालाइन मायोपैथी में तीन माइक्रोबियल प्रोटीन भी विनियमित थे। इनमें से दो माइक्रोप्रोटीन, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (जिसे LINC00598 या Lnc-FOXO1 के नाम से भी जाना जाता है) और ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), केवल टाइप 1 मायोफाइबर में भिन्न मात्रा में पाए गए। ENSG00000215483_TR14_ORF67 को पहले कोशिका चक्र विनियमन में भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है।56 दूसरी ओर, ENSG00000232046_TR1_ORF437 (जो LINC01798 के अनुरूप है) ACTA1-नेमालाइन मायोपैथी में स्वस्थ नियंत्रणों की तुलना में टाइप 1 और टाइप 2A दोनों मायोफाइबर में बढ़ा हुआ पाया गया (पूरक चित्र 12A, पूरक डेटा सेट 24)। इसके विपरीत, राइबोसोमल प्रोटीन नेमालाइन मायोपैथी से काफी हद तक अप्रभावित रहे, हालांकि ACTA1 नेमालाइन मायोपैथी में RPS17 डाउनरेगुलेटेड था (चित्र 6E)।
संवर्धन विश्लेषण से ACTA1 और TNNT1 नेमालाइन मायोपैथी में प्रतिरक्षा प्रणाली प्रक्रियाओं की वृद्धि का भी पता चला, जबकि TNNT1 नेमालाइन मायोपैथी में कोशिका आसंजन भी बढ़ा हुआ था (चित्र 6H)। इन बाह्यकोशिकीय कारकों का संवर्धन बाह्यकोशिकीय मैट्रिक्स प्रोटीन द्वारा PC1 और PC2 में PCA को नकारात्मक दिशा में (अर्थात, सबसे अधिक प्रभावित तंतुओं की ओर) स्थानांतरित करने से परिलक्षित हुआ (चित्र 6J)। दोनों रोगी समूहों ने प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं और सार्कोलेमल मरम्मत तंत्र में शामिल बाह्यकोशिकीय प्रोटीन, जैसे कि एनेक्सिन (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 और उनके परस्पर क्रिया करने वाले प्रोटीन S100A1159 (पूरक चित्र 12B-C) की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति दिखाई। इस प्रक्रिया को पहले मस्कुलर डिस्ट्रॉफी60 में बढ़ा हुआ बताया गया है, लेकिन हमारी जानकारी के अनुसार, इसे पहले नेमालाइन मायोपैथी से नहीं जोड़ा गया है। इस आणविक तंत्र का सामान्य कार्य चोट के बाद सार्कोलेमल मरम्मत और नवगठित मायोसाइट्स के मायोफाइबर के साथ संलयन के लिए आवश्यक है58,61। इस प्रकार, दोनों रोगी समूहों में इस प्रक्रिया की बढ़ी हुई गतिविधि मायोफाइबर अस्थिरता के कारण होने वाली चोट के लिए एक मरम्मतकारी प्रतिक्रिया का सुझाव देती है।
प्रत्येक नेमालाइन मायोपैथी के प्रभाव आपस में अच्छी तरह से सहसंबंधित थे (r = 0.736) और उनमें उचित ओवरलैप दिखाई दिया (पूरक चित्र 11A–B), जो दर्शाता है कि ACTA1 और TNNT1 नेमालाइन मायोपैथी का प्रोटीओम पर समान प्रभाव होता है। हालांकि, कुछ प्रोटीन केवल ACTA1 या TNNT1 नेमालाइन मायोपैथी में ही विनियमित थे (पूरक चित्र 11A और C)। प्रोफाइब्रोटिक प्रोटीन MFAP4, TNNT1 नेमालाइन मायोपैथी में सबसे अधिक अपरेगुलेटेड प्रोटीनों में से एक था, लेकिन ACTA1 नेमालाइन मायोपैथी में अपरिवर्तित रहा। SKIC8, जो HOX जीन प्रतिलेखन को विनियमित करने के लिए जिम्मेदार PAF1C कॉम्प्लेक्स का एक घटक है, TNNT1 नेमालाइन मायोपैथी में डाउनरेगुलेटेड था, लेकिन ACTA1 नेमालाइन मायोपैथी में अप्रभावित रहा (पूरक चित्र 11A)। ACTA1 और TNNT1 नेमालाइन मायोपैथी की सीधी तुलना से पता चला कि TNNT1 नेमालाइन मायोपैथी में माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन में अधिक कमी और प्रतिरक्षा प्रणाली प्रोटीन में अधिक वृद्धि देखी गई (चित्र 6G–H और पूरक चित्र 11C और 11H–I)। ये आंकड़े ACTA1 नेमालाइन मायोपैथी की तुलना में ACTA1 नेमालाइन मायोपैथी में देखी गई अधिक शोष/विकृति (एट्रोफी/डिस्ट्रोफी) के अनुरूप हैं (चित्र 6A), जिससे पता चलता है कि TNNT1 नेमालाइन मायोपैथी इस रोग का अधिक गंभीर रूप है।
यह आकलन करने के लिए कि क्या नेमालाइन मायोपैथी के देखे गए प्रभाव संपूर्ण मांसपेशी स्तर पर बने रहते हैं, हमने TNNT1 नेमालाइन मायोपैथी के रोगियों के एक ही समूह से ली गई मांसपेशी बायोप्सी का बल्क प्रोटीओमिक विश्लेषण किया और उनकी तुलना नियंत्रण समूह (प्रत्येक समूह में n=3) से की (पूरक चित्र 13A, पूरक डेटा सेट 25)। जैसा कि अपेक्षित था, प्रमुख घटक विश्लेषण में नियंत्रण समूह के बीच घनिष्ठ संबंध पाया गया, जबकि TNNT1 नेमालाइन मायोपैथी के रोगियों में अंतर-नमूना परिवर्तनशीलता अधिक थी, जो एकल फाइबर विश्लेषण में देखी गई परिवर्तनशीलता के समान थी (पूरक चित्र 13B)। बल्क विश्लेषण ने अलग-अलग फाइबर की तुलना करके उजागर किए गए विभेदक रूप से व्यक्त प्रोटीन (पूरक चित्र 13C, पूरक डेटा सेट 26) और जैविक प्रक्रियाओं (पूरक चित्र 13D, पूरक डेटा सेट 27) को पुन: प्रस्तुत किया, लेकिन विभिन्न फाइबर प्रकारों के बीच अंतर करने की क्षमता खो दी और फाइबर में विषम रोग प्रभावों को ध्यान में रखने में विफल रहा।
कुल मिलाकर, ये आंकड़े दर्शाते हैं कि एकल-मायोफाइबर प्रोटीओमिक्स उन नैदानिक ​​जैविक विशेषताओं को स्पष्ट कर सकता है जिन्हें इम्यूनोब्लॉटिंग जैसी लक्षित विधियों द्वारा पता नहीं लगाया जा सकता है। इसके अलावा, ये आंकड़े फेनोटाइपिक अनुकूलन का वर्णन करने के लिए अकेले एक्टिन फाइबर टाइपिंग (MYH) के उपयोग की सीमाओं को उजागर करते हैं। वास्तव में, हालांकि एक्टिन और ट्रोपोनिन नेमालाइन मायोपैथी में फाइबर प्रकार स्विचिंग भिन्न होती है, दोनों नेमालाइन मायोपैथी कंकाल की मांसपेशियों के फाइबर चयापचय से MYH फाइबर टाइपिंग को अलग करती हैं, जिससे मांसपेशियों का प्रोटीओम तेज और कम ऑक्सीडेटिव हो जाता है।
ऊतकों की विविध आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए कोशिकीय विषमता महत्वपूर्ण है। कंकाल की मांसपेशियों में, इसे अक्सर बल उत्पादन और थकान की विभिन्न डिग्री द्वारा विशेषता प्राप्त फाइबर प्रकारों के रूप में वर्णित किया जाता है। हालांकि, यह स्पष्ट है कि यह कंकाल की मांसपेशियों के फाइबर की परिवर्तनशीलता के केवल एक छोटे से हिस्से की व्याख्या करता है, जो पहले की सोच से कहीं अधिक परिवर्तनशील, जटिल और बहुआयामी है। तकनीकी प्रगति ने अब कंकाल की मांसपेशियों के फाइबर को नियंत्रित करने वाले कारकों पर प्रकाश डाला है। वास्तव में, हमारे डेटा से पता चलता है कि टाइप 2X फाइबर एक विशिष्ट कंकाल की मांसपेशियों के फाइबर का उपप्रकार नहीं हो सकता है। इसके अलावा, हमने चयापचय प्रोटीन, राइबोसोमल प्रोटीन और कोशिका-संबंधित प्रोटीन को कंकाल की मांसपेशियों के फाइबर की विषमता के प्रमुख निर्धारक के रूप में पहचाना। नेमाटोड मायोपैथी वाले रोगी नमूनों पर अपनी प्रोटिओमिक कार्यप्रणाली को लागू करके, हमने आगे प्रदर्शित किया कि MYH-आधारित फाइबर टाइपिंग कंकाल की मांसपेशियों की विषमता को पूरी तरह से प्रतिबिंबित नहीं करती है, विशेष रूप से जब प्रणाली में गड़बड़ी होती है। वास्तव में, एमवाईएच-आधारित फाइबर प्रकार की परवाह किए बिना, नेमाटोड मायोपैथी के परिणामस्वरूप तेज और कम ऑक्सीडेटिव फाइबर की ओर बदलाव होता है।
कंकाल की मांसपेशियों के रेशों का वर्गीकरण 19वीं शताब्दी से किया जा रहा है। हाल के ओमिक्स विश्लेषणों ने हमें विभिन्न MYH रेशों के प्रकारों की अभिव्यक्ति प्रोफाइल और विभिन्न उत्तेजनाओं के प्रति उनकी प्रतिक्रियाओं को समझना शुरू करने में सक्षम बनाया है। जैसा कि यहाँ वर्णित है, ओमिक्स दृष्टिकोणों का लाभ यह भी है कि ये पारंपरिक एंटीबॉडी-आधारित विधियों की तुलना में रेशे के प्रकार के मार्करों की मात्रा निर्धारित करने में अधिक संवेदनशील होते हैं, और कंकाल की मांसपेशियों के रेशे के प्रकार को परिभाषित करने के लिए किसी एक (या कुछ) मार्कर की मात्रा पर निर्भर नहीं करते हैं। हमने पूरक ट्रांसक्रिप्टोमिक और प्रोटिओमिक कार्यप्रवाहों का उपयोग किया और मानव कंकाल की मांसपेशियों के रेशों में रेशे की विषमता के प्रतिलेखन और प्रतिलेखन के बाद के विनियमन की जांच करने के लिए परिणामों को एकीकृत किया। इस कार्यप्रवाह के परिणामस्वरूप स्वस्थ युवा पुरुषों के हमारे समूह के वास्टस लेटरलिस में प्रोटीन स्तर पर शुद्ध 2X-प्रकार के रेशों की पहचान करने में विफलता मिली। यह पिछले एकल रेशे अध्ययनों के अनुरूप है जिनमें स्वस्थ वास्टस लेटरलिस में <1% शुद्ध 2X रेशे पाए गए थे, हालांकि भविष्य में अन्य मांसपेशियों में इसकी पुष्टि की जानी चाहिए। mRNA स्तर पर लगभग शुद्ध 2X फाइबर की पहचान और प्रोटीन स्तर पर केवल मिश्रित 2A/2X फाइबर की पहचान के बीच का अंतर perplexing है। MYH आइसोफॉर्म mRNA अभिव्यक्ति सर्कैडियन नहीं है,67 जिससे पता चलता है कि RNA स्तर पर दिखने में शुद्ध 2X फाइबर में MYH2 आरंभिक संकेत को हमने शायद ही "छूट" दी हो। एक संभावित स्पष्टीकरण, हालांकि पूरी तरह से काल्पनिक, MYH आइसोफॉर्म के बीच प्रोटीन और/या mRNA स्थिरता में अंतर हो सकता है। वास्तव में, कोई भी तीव्र फाइबर किसी भी MYH आइसोफॉर्म के लिए 100% शुद्ध नहीं होता है, और यह स्पष्ट नहीं है कि 70-90% सीमा में MYH1 mRNA अभिव्यक्ति स्तर प्रोटीन स्तर पर MYH1 और MYH2 की समान प्रचुरता का कारण बनेगा या नहीं। हालांकि, जब संपूर्ण ट्रांसक्रिप्टोम या प्रोटीओम पर विचार किया जाता है, तो क्लस्टर विश्लेषण उनकी सटीक MYH संरचना की परवाह किए बिना, धीमी और तीव्र कंकाल मांसपेशी फाइबर का प्रतिनिधित्व करने वाले केवल दो अलग-अलग समूहों की आत्मविश्वास से पहचान कर सकता है। यह एकल-नाभिकीय ट्रांसक्रिप्टोमिक दृष्टिकोणों का उपयोग करके किए गए विश्लेषणों के अनुरूप है, जो आमतौर पर केवल दो विशिष्ट मायोन्यूक्लियर समूहों की पहचान करते हैं। 68, 69, 70 इसके अलावा, हालांकि पिछले प्रोटिओमिक अध्ययनों ने टाइप 2X फाइबर की पहचान की है, ये फाइबर बाकी फास्ट फाइबर से अलग से समूह नहीं बनाते हैं और MYH के आधार पर अन्य फाइबर प्रकारों की तुलना में केवल कुछ ही भिन्न रूप से प्रचुर मात्रा में प्रोटीन दिखाते हैं। 14 ये परिणाम बताते हैं कि हमें मांसपेशियों के फाइबर वर्गीकरण के 20वीं सदी के शुरुआती दृष्टिकोण पर वापस लौटना चाहिए, जिसने मानव कंकाल की मांसपेशियों के फाइबर को MYH के आधार पर तीन अलग-अलग वर्गों में नहीं, बल्कि उनके चयापचय और संकुचन गुणों के आधार पर दो समूहों में विभाजित किया था। 63
इससे भी अधिक महत्वपूर्ण बात यह है कि मायोफाइबर विषमता पर कई आयामों से विचार किया जाना चाहिए। पिछले "ओमिक्स" अध्ययनों ने इस दिशा में संकेत दिया है, जिससे पता चलता है कि कंकाल की मांसपेशी फाइबर अलग-अलग समूह नहीं बनाते हैं बल्कि एक निरंतरता के साथ व्यवस्थित होते हैं। 11, 13, 14, 64, 71 यहां, हम दिखाते हैं कि कंकाल की मांसपेशियों के संकुचनशील और चयापचय गुणों में अंतर के अलावा, मायोफाइबर को कोशिका-कोशिका अंतःक्रियाओं और अनुवाद तंत्र से संबंधित विशेषताओं द्वारा विभेदित किया जा सकता है। वास्तव में, हमने कंकाल की मांसपेशी फाइबर में राइबोसोम विषमता पाई जो धीमी और तेज फाइबर प्रकारों से स्वतंत्र विषमता में योगदान करती है। धीमी और तेज फाइबर प्रकार से स्वतंत्र इस पर्याप्त मायोफाइबर विषमता का अंतर्निहित कारण अभी भी स्पष्ट नहीं है, लेकिन यह मांसपेशी फासिकल्स के भीतर विशेष स्थानिक संगठन की ओर इशारा कर सकता है जो विशिष्ट बलों और भारों के लिए इष्टतम रूप से प्रतिक्रिया करता है, 72 मांसपेशी सूक्ष्म वातावरण में अन्य कोशिका प्रकारों के साथ विशेष कोशिकीय या अंग-विशिष्ट संचार 73,74,75 या व्यक्तिगत मायोफाइबर के भीतर राइबोसोम गतिविधि में अंतर। वास्तव में, राइबोसोमल हेटरोप्लास्मी, या तो आरपीएल3 और आरपीएल3एल के पैरालॉगस प्रतिस्थापन के माध्यम से या आरआरएनए के 2'ओ-मेथिलेशन के स्तर पर, कंकाल की मांसपेशियों के अतिवृद्धि से जुड़ा हुआ दिखाया गया है76,77। व्यक्तिगत मायोफाइबर के कार्यात्मक लक्षण वर्णन के साथ संयुक्त बहु-ओमिक और स्थानिक अनुप्रयोग बहु-ओमिक स्तर पर मांसपेशी जीव विज्ञान की हमारी समझ को और आगे बढ़ाएंगे78।
नेमालाइन मायोपैथी से पीड़ित रोगियों के एकल मायोफाइबर के प्रोटीओम का विश्लेषण करके, हमने कंकाल की मांसपेशियों की नैदानिक ​​पैथोफिजियोलॉजी को स्पष्ट करने के लिए एकल मायोफाइबर प्रोटीओमिक्स की उपयोगिता, प्रभावशीलता और प्रयोज्यता को भी प्रदर्शित किया। इसके अलावा, वैश्विक प्रोटीओमिक विश्लेषण के साथ अपनी कार्यप्रणाली की तुलना करके, हम यह प्रदर्शित करने में सक्षम थे कि एकल मायोफाइबर प्रोटीओमिक्स वैश्विक ऊतक प्रोटीओमिक्स के समान ही गहन जानकारी प्रदान करता है और अंतरफाइबर विषमता और मायोफाइबर प्रकार को ध्यान में रखते हुए इस गहनता को बढ़ाता है। स्वस्थ नियंत्रणों की तुलना में ACTA1 और TNNT1 नेमालाइन मायोपैथी में देखे गए फाइबर प्रकार अनुपात में अपेक्षित (यद्यपि परिवर्तनशील) अंतरों के अतिरिक्त,19 हमने MYH-मध्यस्थ फाइबर प्रकार स्विचिंग से स्वतंत्र ऑक्सीडेटिव और बाह्यकोशिकीय रीमॉडलिंग भी देखी। पहले TNNT1 नेमालाइन मायोपैथी में फाइब्रोसिस की रिपोर्ट की गई थी।19 हालांकि, हमारा विश्लेषण ACTA1 और TNNT1 नेमालाइन मायोपैथी वाले रोगियों के मायोफाइबर में सार्कोलेमल मरम्मत तंत्र में शामिल एनेक्सिन जैसे बाह्य स्रावित तनाव-संबंधित प्रोटीन के बढ़े हुए स्तरों को प्रकट करके इस निष्कर्ष को आगे बढ़ाता है।57,58,59 निष्कर्षतः, नेमालाइन मायोपैथी वाले रोगियों के मायोफाइबर में बढ़े हुए एनेक्सिन स्तर गंभीर रूप से एट्रोफिक मायोफाइबर की मरम्मत के लिए एक सेलुलर प्रतिक्रिया का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं।
हालांकि यह अध्ययन अब तक मनुष्यों में किए गए एकल-फाइबर संपूर्ण-मांसपेशी-ओमिक्स विश्लेषण का सबसे बड़ा अध्ययन है, फिर भी इसकी कुछ सीमाएँ हैं। हमने प्रतिभागियों के अपेक्षाकृत छोटे और समरूप नमूने और एक ही मांसपेशी (वास्टस लेटरलिस) से कंकाल की मांसपेशियों के रेशों को अलग किया। इसलिए, विभिन्न प्रकार की मांसपेशियों और मांसपेशियों की शारीरिक क्रिया विज्ञान की चरम सीमाओं पर विशिष्ट रेशों की आबादी के अस्तित्व को नकारना असंभव है। उदाहरण के लिए, हम इस संभावना को नकार नहीं सकते कि अत्यधिक प्रशिक्षित धावकों और/या शक्ति एथलीटों79 में या मांसपेशियों की निष्क्रियता की अवधि के दौरान अल्ट्राफास्ट रेशों (जैसे, शुद्ध 2X रेशे) का एक उपसमूह उभर सकता है66,80। इसके अलावा, प्रतिभागियों के सीमित नमूना आकार ने हमें रेशों की विषमता में लिंग भेदों की जांच करने से रोक दिया, क्योंकि रेशों के प्रकार का अनुपात पुरुषों और महिलाओं में भिन्न होता है। साथ ही, हम एक ही मांसपेशी रेशों या एक ही प्रतिभागियों के नमूनों पर ट्रांसक्रिप्टोमिक और प्रोटीओमिक विश्लेषण करने में असमर्थ थे। जैसे-जैसे हम और अन्य लोग ओमिक्स विश्लेषण का उपयोग करके एकल-कोशिका और एकल-मायोफाइबर विश्लेषण को अनुकूलित करना जारी रखते हैं ताकि अल्ट्रा-लो नमूना इनपुट प्राप्त किया जा सके (जैसा कि यहां माइटोकॉन्ड्रियल मायोपैथी वाले रोगियों से फाइबर के विश्लेषण में प्रदर्शित किया गया है), एकल मांसपेशी फाइबर के भीतर मल्टी-ओमिक्स (और कार्यात्मक) दृष्टिकोणों को संयोजित करने का अवसर स्पष्ट हो जाता है।
कुल मिलाकर, हमारे डेटा कंकाल की मांसपेशियों की विषमता के प्रतिलेखन और प्रतिलेखन के बाद के कारकों की पहचान और व्याख्या करते हैं। विशेष रूप से, हम ऐसे डेटा प्रस्तुत करते हैं जो फाइबर प्रकारों की पारंपरिक MYH-आधारित परिभाषा से जुड़े कंकाल की मांसपेशियों के शरीर विज्ञान में लंबे समय से चली आ रही एक मान्यता को चुनौती देते हैं। हम इस बहस को पुनः शुरू करने और अंततः कंकाल की मांसपेशियों के फाइबर वर्गीकरण और विषमता के बारे में हमारी समझ पर पुनर्विचार करने की आशा करते हैं।
चौदह श्वेत प्रतिभागियों (12 पुरुष और 2 महिलाएं) ने स्वेच्छा से इस अध्ययन में भाग लेने की सहमति दी। इस अध्ययन को गेन्ट विश्वविद्यालय अस्पताल की नैतिकता समिति (BC-10237) द्वारा अनुमोदित किया गया था, यह 2013 के हेलसिंकी घोषणा का अनुपालन करता था, और ClinicalTrials.gov (NCT05131555) पर पंजीकृत था। प्रतिभागियों की सामान्य विशेषताओं को अनुपूरक तालिका 1 में प्रस्तुत किया गया है। मौखिक और लिखित सूचित सहमति प्राप्त करने के बाद, प्रतिभागियों को अध्ययन में अंतिम रूप से शामिल करने से पहले एक चिकित्सा परीक्षण से गुजरना पड़ा। प्रतिभागी युवा (22-42 वर्ष), स्वस्थ (कोई चिकित्सीय स्थिति नहीं, धूम्रपान का कोई इतिहास नहीं), और मध्यम रूप से शारीरिक रूप से सक्रिय थे। अधिकतम ऑक्सीजन ग्रहण क्षमता का निर्धारण पहले वर्णित अनुसार शारीरिक फिटनेस का आकलन करने के लिए स्टेप एर्गोमीटर का उपयोग करके किया गया था। 81
मांसपेशियों के बायोप्सी नमूने विश्राम की स्थिति में और उपवास की स्थिति में तीन बार, 14 दिनों के अंतराल पर एकत्र किए गए। चूंकि ये नमूने एक बड़े अध्ययन के हिस्से के रूप में एकत्र किए गए थे, इसलिए प्रतिभागियों ने बायोप्सी से 40 मिनट पहले प्लेसबो (लैक्टोज), एक H1-रिसेप्टर विरोधी (540 मिलीग्राम फेक्सोफेनाडाइन), या एक H2-रिसेप्टर विरोधी (40 मिलीग्राम फैमोटिडाइन) का सेवन किया। हमने पहले ही प्रदर्शित किया है कि ये हिस्टामाइन रिसेप्टर विरोधी विश्राम की स्थिति में कंकाल की मांसपेशियों की फिटनेस को प्रभावित नहीं करते हैं81, और हमारे गुणवत्ता नियंत्रण प्लॉटों में कोई स्थिति-संबंधी क्लस्टरिंग नहीं देखी गई (पूरक चित्र 3 और 6)। प्रत्येक प्रायोगिक दिन से 48 घंटे पहले एक मानकीकृत आहार (41.4 किलो कैलोरी/किलोग्राम शरीर के वजन, 5.1 ग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन कार्बोहाइड्रेट, 1.4 ग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन प्रोटीन और 1.6 ग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन वसा) का पालन किया गया, और प्रायोगिक दिन की सुबह एक मानकीकृत नाश्ता (1.5 ग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन कार्बोहाइड्रेट) का सेवन किया गया। स्थानीय एनेस्थीसिया (0.5 मिली 1% लिडोकेन बिना एपिनेफ्रिन के) के तहत, परक्यूटेनियस बर्गस्ट्रॉम एस्पिरेशन का उपयोग करके वास्टस लेटरलिस मांसपेशी से मांसपेशी बायोप्सी प्राप्त की गई।82 मांसपेशी के नमूनों को तुरंत आरएनएलेटर में एम्बेड किया गया और मैनुअल फाइबर विच्छेदन (3 दिनों तक) तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया।
ताज़ा पृथक किए गए मायोफाइबर बंडलों को एक कल्चर डिश में ताज़ा आरएनएलेटर माध्यम में स्थानांतरित किया गया। फिर एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप और महीन चिमटी का उपयोग करके व्यक्तिगत मायोफाइबरों को मैन्युअल रूप से विच्छेदित किया गया। प्रत्येक बायोप्सी से पच्चीस फाइबर विच्छेदित किए गए, बायोप्सी के विभिन्न क्षेत्रों से फाइबर का चयन करने पर विशेष ध्यान दिया गया। विच्छेदन के बाद, अवांछित प्रोटीन और डीएनए को हटाने के लिए प्रत्येक फाइबर को प्रोटीनएज़ K और डीएनएज़ एंजाइम युक्त 3 μl लाइसिस बफर (सिंगलशॉट सेल लाइसिस किट, बायो-रैड) में धीरे से डुबोया गया। फिर संक्षिप्त वर्टेक्सिंग, माइक्रोसेन्ट्रीफ्यूज में तरल को स्पिन करके और कमरे के तापमान पर (10 मिनट) इनक्यूबेट करके सेल लाइसिस और प्रोटीन/डीएनए निष्कासन शुरू किया गया। इसके बाद लाइसैट को थर्मल साइक्लर (T100, बायो-रैड) में 37°C पर 5 मिनट और 75°C पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया, और फिर आगे की प्रक्रिया तक तुरंत -80°C पर संग्रहित किया गया।
इलुमिना-संगत पॉलीएडेनिलेटेड आरएनए लाइब्रेरी को क्वांटसेक-पूल 3′ एमआरएनए-सेक लाइब्रेरी प्रेप किट (लेक्सोजेन) का उपयोग करके 2 µl मायोफाइबर लाइसैट से तैयार किया गया था। विस्तृत विधि निर्माता के मैनुअल में पाई जा सकती है। प्रक्रिया रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन द्वारा प्रथम-स्ट्रैंड सीडीएनए संश्लेषण से शुरू होती है, जिसके दौरान नमूनों के पूलिंग को सुनिश्चित करने और आगे की प्रक्रिया के दौरान तकनीकी भिन्नता को कम करने के लिए अद्वितीय आणविक पहचानकर्ता (यूएमआई) और नमूना-विशिष्ट i1 बारकोड शामिल किए जाते हैं। इसके बाद 96 मायोफाइबर से सीडीएनए को पूल किया जाता है और चुंबकीय मोतियों से शुद्ध किया जाता है, जिसके बाद आरएनए को हटा दिया जाता है और यादृच्छिक प्राइमर का उपयोग करके द्वितीय-स्ट्रैंड संश्लेषण किया जाता है। लाइब्रेरी को चुंबकीय मोतियों से शुद्ध किया जाता है, पूल-विशिष्ट i5/i7 टैग जोड़े जाते हैं, और पीसीआर द्वारा प्रवर्धित किया जाता है। अंतिम शुद्धिकरण चरण इलुमिना-संगत लाइब्रेरी तैयार करता है। प्रत्येक लाइब्रेरी पूल की गुणवत्ता का आकलन हाई सेंसिटिविटी स्मॉल फ्रैगमेंट डीएनए एनालिसिस किट (एजिलेंट टेक्नोलॉजीज, डीएनएफ-477-0500) का उपयोग करके किया गया था।
क्यूबिट मात्रा निर्धारण के आधार पर, पूलों को सममोलर सांद्रता (2 nM) पर आगे पूल किया गया। परिणामी पूल को फिर नोवासेक 6000 उपकरण पर मानक मोड में नोवासेक एस2 रिएजेंट किट (1 × 100 न्यूक्लियोटाइड) का उपयोग करके 2 nM लोडिंग (4% PhiX) के साथ अनुक्रमित किया गया।
हमारी पाइपलाइन लेक्सोजेन की क्वांटसेक पूल डेटा विश्लेषण पाइपलाइन (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis) पर आधारित है। डेटा को सबसे पहले i7/i5 इंडेक्स के आधार पर bcl2fastq2 (v2.20.0) से डीमल्टीप्लेक्स किया गया। इसके बाद, i1 सैंपल बारकोड के आधार पर रीड 2 को idemux (v0.1.6) से डीमल्टीप्लेक्स किया गया और umi_tools (v1.0.1) से UMI सीक्वेंस निकाले गए। फिर, कटएडैप्ट (v3.4) से कई चरणों में रीड्स को ट्रिम किया गया ताकि छोटी रीड्स (<20 लंबाई) या केवल एडेप्टर सीक्वेंस वाली रीड्स को हटाया जा सके। इसके बाद, STAR (v2.6.0c) का उपयोग करके रीड्स को मानव जीनोम के साथ अलाइन किया गया और SAMtools (v1.11) से BAM फाइलों को इंडेक्स किया गया। umi_tools (v1.0.1) का उपयोग करके डुप्लिकेट रीड्स को हटाया गया। अंत में, सबरीड (v2.0.3) में फीचरकाउंट्स का उपयोग करके अलाइनमेंट काउंटिंग की गई। पाइपलाइन के कई मध्यवर्ती चरणों में फास्टक्यूसी (v0.11.9) का उपयोग करके गुणवत्ता नियंत्रण किया गया।
आगे की सभी बायोइन्फॉर्मेटिक्स प्रोसेसिंग और विज़ुअलाइज़ेशन R (v4.2.3) में की गई, मुख्य रूप से Seurat (v4.4.0) वर्कफ़्लो का उपयोग करते हुए। 83 इसलिए, व्यक्तिगत UMI मानों और मेटाडेटा मैट्रिक्स को Seurat ऑब्जेक्ट में रूपांतरित किया गया। उन जीनों को हटा दिया गया जो सभी फाइबर्स के 30% से कम में व्यक्त किए गए थे। कम गुणवत्ता वाले नमूनों को 1000 UMI मानों और 1000 पहचाने गए जीनों की न्यूनतम सीमा के आधार पर हटा दिया गया। अंततः, 925 फाइबर्स सभी गुणवत्ता नियंत्रण फ़िल्टरिंग चरणों से गुज़रे। UMI मानों को Seurat SCTransform v2 विधि 84 का उपयोग करके सामान्यीकृत किया गया, जिसमें सभी 7418 पहचाने गए फ़ीचर शामिल थे, और प्रतिभागियों के बीच के अंतरों को रिग्रेशन द्वारा हटा दिया गया। सभी प्रासंगिक मेटाडेटा पूरक डेटासेट 28 में पाया जा सकता है।